固氮施氏假單胞菌RNA分子伴侶蛋白Hfq與碳代謝抑制蛋白Crc在碳代謝途徑中的協(xié)同作用.pdf

1、微生物在多種碳源存在的情況下，優(yōu)先選擇優(yōu)勢碳源而抑制非優(yōu)勢碳源的利用，這種現(xiàn)象稱為碳代謝物抑制。在假單胞菌中，全局調(diào)控因子Crc被認為是參與碳代謝抑制調(diào)控的核心蛋白，可通過與靶標基因的mRNA互作進而發(fā)揮調(diào)控作用。近年來，有研究認為RNA分子伴侶Hfq參與了Crc與靶標mRNA的分子互作，Hfq可通過與mRNA分子的互作進而調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性目前關(guān)于兩種不同的學(xué)術(shù)觀點仍存在爭議，而Hfq和Crc在固氮菌中的研究尚未見報道。固氮施氏假單胞菌A1

2、501分離自水稻根際，如何高效利用根際環(huán)境中復(fù)雜的碳源對該菌的根際定殖及環(huán)境適應(yīng)至關(guān)重要，但是該菌中Crc與Hfq蛋白在碳源利用調(diào)控過程中的功能及其協(xié)同作用缺乏分子證據(jù)。本研究在實驗室已有hfq突變株和crc突變株基礎(chǔ)上，通過hfq和crc雙突變株的構(gòu)建，重點分析了Hfq和Crc在混合碳源利用中的生理生化表型，初步研究了Hfq及Crc在碳代謝調(diào)控中的作用機制，取得了以下結(jié)果：
　　1、研究了Hfq和Crc蛋白在碳代謝途徑中的生物學(xué)

3、功能。分別測定了hfq和crc單突變株和雙突變株在單一碳源及混合碳源（優(yōu)勢碳源與非優(yōu)勢碳源混合）條件下的生長能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在優(yōu)勢碳源（乳酸鈉和琥珀酸）為單一碳源條件下，突變株與野生型的生長能力均無顯著差異，而在兩種非優(yōu)勢碳源（苯甲酸和葡萄糖）為唯一碳源條件下，crc和hfq單突變株生長能力顯著下降，而雙突變株基本不能生長。在優(yōu)勢碳源乳酸鈉與非優(yōu)勢碳源苯甲酸混合培養(yǎng)條件下，crc和hfq單突變株生長能力增強，而雙突變株生長能力較弱。以上

4、結(jié)果表明，在非優(yōu)勢碳源存在的情況下（無論單一碳源或混合碳源），crc和hfq雙突變株產(chǎn)生的表型變化水平都顯著強于單突變株，暗示兩者可能存在功能上的疊加。以苯甲酸代謝為研究對象，通過實時定量RT-PCR分析了苯甲酸存在條件下（單一、混合碳源）苯甲酸降解關(guān)鍵基因的表達變化，結(jié)果表明，與野生型和單突變株相比，crc和hfq雙突變株中苯甲酸代謝基因benA、benR、benK表達量顯著下調(diào)。根據(jù)以上結(jié)果，推測在A1501菌中，Hfq和Crc在碳

5、源代謝途徑中發(fā)揮著協(xié)同作用。
　　2、采用原核表達體系表達純化了Crc和Hfq蛋白，并通過微量熱涌動實驗（MST）檢測了Crc和Hfq蛋白與靶標分子BenR（苯甲酸降解調(diào)控基因）的mRNA的體外互作。結(jié)果顯示，Hfq可與苯甲酸降解調(diào)控基因benR特異性結(jié)合。說明Hfq參與了以Crc為主要調(diào)控蛋白的碳代謝抑制途徑。
　　3、施氏假單胞菌A1501中hfq和crc基因的同時突變并不影響菌株在LB培養(yǎng)基中的生長。在低氨、微好氧條件

6、下的固氮酶活測定顯示hfq和crc基因突變后施氏假單胞菌A1501的固氮酶活明顯下降。并且氮代謝調(diào)控基因（nifA、nifK、glnA、glnK）表達量都發(fā)生下調(diào)。與此同時hfq和crc基因突變后使A1501喪失趨化能力，說明Hfq和Crc在A1501的固氮過程中同時發(fā)揮重要的功能，從而影響其它代謝途徑。
　　綜上所述，施氏假單胞菌A1501調(diào)控蛋白Crc與Hfq在碳代謝抑制調(diào)控中存在協(xié)同作用，同時Crc與Hfq蛋白可能以某種未知