日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗的構(gòu)建及免疫應(yīng)答的動(dòng)態(tài)觀察.pdf

1、目的：
　　日本血吸蟲病是由日本血吸蟲（Schistosoma japonicum，Sj）引起的一種危害人體健康的地方性人獸共患寄生蟲病。由于該病危害大，因此研發(fā)有效的疫苗防治該病已是勢在必行。本研究擬構(gòu)建Sj重組兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum，Bb)(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗，并研究其免疫BALB/c小鼠后免疫應(yīng)答的動(dòng)態(tài)變化，以期為Sj的免疫預(yù)防提供一條新途徑。
　　方法：

2、r>　　從我室保存的BL21(DE3)(pET28α-Sj26GST-Sj32)重組菌中抽提質(zhì)粒pET28α-Sj26GST-Sj32，PCR擴(kuò)增Sj26GST-Sj32融合基因，將該融合基因定向克隆到大腸埃希菌-雙歧桿菌穿梭表達(dá)載體pGEX-1λT中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-Sj26GST-Sj32。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，抽提質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切，鑒定載體片段及目的基因片段長度。用電穿孔法將重組質(zhì)粒pGEX-Sj

3、26GST-Sj32轉(zhuǎn)化至Bb，構(gòu)建Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗，抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后以SDS-PAGE及Western-blot對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。
　　將96只BALB/c小鼠隨機(jī)分為2組，每組48只，用重組Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗分別經(jīng)口服灌胃和鼻腔粘膜兩種途徑免疫小鼠，在免疫后0～22周每兩周兩組分別剖殺4只小鼠，分離血清，ELI

4、SA法測定血清抗體及細(xì)胞因子;取脾并分離脾細(xì)胞，用Sj成蟲抗原（SjAWA抗原）和刀豆蛋白A(ConA)刺激培養(yǎng)，四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測免疫小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)，同時(shí)設(shè)原液組對照;用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測免疫小鼠脾CD4+和CD8+T細(xì)胞亞群的百分比;脾細(xì)胞經(jīng)SjAWA抗原及ConA刺激培養(yǎng)，收集培養(yǎng)的上清液，雙抗體夾心ELISA法檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液的IL-10及IL-12水平，設(shè)原液組(stock group)作為對照

5、;脾細(xì)胞經(jīng)ConA培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測脾細(xì)胞的凋亡發(fā)生率，并設(shè)原液組作為對照。
　　結(jié)果：
　　PCR成功擴(kuò)增出長度為1991 bp的Sj26GST-Sj32融合基因;雙酶切證實(shí)Sj26GST-Sj32融合基因成功插入質(zhì)粒pGEX-1λT中;PCR證實(shí)從重組Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗中擴(kuò)增出1991 bp的Sj26GST-Sj32融合基因;SDS-PAGE分析顯示將重組質(zhì)粒pGEX-Sj26GST-Sj3

6、2在E.coli BL21中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，得到分子量約85kDa的條帶，其中以5～7h處表達(dá)水平較高;Western-blot發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒pGEX-Sj26GST-Sj32表達(dá)產(chǎn)物可被Sj感染的兔血清識(shí)別。
　　口服免疫(per os，PO)組小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE和IgA水平分別在免疫后6、8、8、4、6、12和6周達(dá)峰值;血清IL-10和IL-12水平分別在免疫后12、6周達(dá)

7、峰值。鼻腔粘膜(intranasal，IN)組小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE和IgA水平分別在免疫后4、2、6、2、4、8和8周達(dá)峰值;血清IL-10和IL-12水平分別于免疫后6周達(dá)峰值。PO組增殖水平于免疫后4w達(dá)高峰，而IN組于免疫后12w達(dá)高峰。PO組脾CD4+T細(xì)胞亞群于免疫后4w達(dá)最高水平，IN組CD4+T細(xì)胞亞群于免疫后12w達(dá)最高水平;PO組脾CD8+T細(xì)胞亞群于10w達(dá)峰值，IN組C

8、D8+T細(xì)胞亞群于免疫后6w達(dá)最高水平。PO組和IN組小鼠脾細(xì)胞IL-10水平均于免疫后6w達(dá)最高;PO組小鼠脾細(xì)胞IL-12水平于免疫后6w達(dá)最高，IN組脾細(xì)胞IL-12水平于12w達(dá)最高水平。PO組小鼠脾細(xì)胞凋亡率于免疫后6w達(dá)最高，而IN組脾細(xì)胞凋亡率于12w達(dá)最高水平。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗;該疫苗在免疫早期可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生有效地Th1和Th2型混合性免疫