皮膚源性前體細(xì)胞體外分化與細(xì)胞體內(nèi)移植延緩失神經(jīng)肌肉萎縮的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分:GFP轉(zhuǎn)基因大鼠皮膚源性前體細(xì)胞體外向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化及表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:研究從成體GFP轉(zhuǎn)基因大鼠背部皮膚分離、體外增殖皮膚源性前體細(xì)胞(skin-derived precursors，SKPs)的方法，并探討皮膚源性前體細(xì)胞的生物學(xué)特性。在體外條件下，將皮膚源性前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，研究皮膚源性前體細(xì)胞以及誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞后神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)情況。
　　方法:從GFP轉(zhuǎn)基因大

2、鼠背側(cè)皮膚分離細(xì)胞后，在促分裂劑堿性成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2)和表皮生長因子(EGF)存在的條件下懸浮培養(yǎng)。行細(xì)胞標(biāo)志物巢蛋白(nestin)，纖維連接蛋白（fibronectin），β-tubulinⅢ、Sox2、神經(jīng)絲蛋白（neurofilament，NF）、微管相關(guān)蛋白2(microtubule associated protein2，MAP2)免疫熒光染色和流式細(xì)胞儀檢測。傳3代后，皮膚源性前體細(xì)胞經(jīng)含有神經(jīng)生長因子(NG

3、F)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)素-3(NT-3)等的誘導(dǎo)分化劑誘導(dǎo)分化2-4周。分別在誘導(dǎo)分化前和誘導(dǎo)分化后3周時采用RT-PCR測定皮膚源性前體細(xì)胞和皮膚源性前體細(xì)胞體外向神經(jīng)元分化的細(xì)胞神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:大鼠皮膚源性前體細(xì)胞可采用從腦內(nèi)分離神經(jīng)干細(xì)胞相類似的方法從GFP大鼠背側(cè)皮膚獲得。所獲得并體外增殖形成的細(xì)

4、胞神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物巢蛋白(nestin)染色陽性，神經(jīng)元標(biāo)志物β-tubulinⅢ陽性。皮膚源性前體細(xì)胞還表達(dá)一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生的纖維連接蛋白，但卻不表達(dá)神經(jīng)嵴干細(xì)胞標(biāo)志物p75神經(jīng)營養(yǎng)素受體(p75NTR)以及多唾液酸-神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(PSA-NCAM)。皮膚源性前體細(xì)胞可以同時表達(dá)巢蛋白和纖維連接蛋白(fibronectin)。傳3代后，仍有60％以上的細(xì)胞呈現(xiàn)巢蛋白染色陽性。分別從成體表皮、真皮和坐骨神經(jīng)分離獲得細(xì)胞在相同

5、培養(yǎng)條件下，僅有真皮中分離出細(xì)胞能增殖、懸浮生長并成球，并且也同時表達(dá)巢蛋白和纖維連接蛋白。皮膚源性前體細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)前就已經(jīng)存在于真皮組織中。皮膚源性前體細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞不同，表現(xiàn)在皮膚源性前體細(xì)胞不表達(dá)波形蛋白(vimentin)和細(xì)胞角蛋白(cytokeratin)。皮膚源性前體細(xì)胞可被誘導(dǎo)分化為皮膚組織中原本并不存在的神經(jīng)元樣細(xì)胞，nestin、β-tubulinⅢ、神經(jīng)絲（neurofilament，NF）和微管相關(guān)蛋白2(

6、microtubule associatedprotein2，MAP2)免疫熒光染色陽性。無論皮膚源性前體細(xì)胞或其誘導(dǎo)分化成的神經(jīng)元樣細(xì)胞在體外環(huán)境中均表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF、GDNF和CNTF。
　　結(jié)論:皮膚源性前體細(xì)胞是一種內(nèi)源性的前體細(xì)胞?？赏瑫r表達(dá)巢蛋白和纖維連接蛋白的皮膚源性前體細(xì)胞可從成體真皮組織中獲得，其與間充質(zhì)于細(xì)胞有本質(zhì)區(qū)別。在特定條件下，皮膚源性前體細(xì)胞可被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，表達(dá)成熟神經(jīng)元標(biāo)志

7、物。皮膚源性前體細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化成的神經(jīng)元樣細(xì)胞均能表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子。皮膚源性前體細(xì)胞代表了一種新型的易獲得、可增殖、可誘導(dǎo)成神經(jīng)元樣細(xì)胞的干細(xì)胞。
　　第二部分:皮膚源性前體細(xì)胞在周圍神經(jīng)內(nèi)存活及皮膚源性前體細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞在周圍神經(jīng)內(nèi)存活的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:研究皮膚源性前體細(xì)胞和皮膚源性前體細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞體內(nèi)移植，移植時機(jī)、移植周圍微環(huán)境對移植細(xì)胞存活率的影響，以及移植細(xì)胞在損傷的周圍神經(jīng)

8、中神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)情況。
　　方法:根據(jù)可能導(dǎo)致細(xì)胞生存微環(huán)境改變的因素，將受體模型Lewis大鼠隨機(jī)分為脛神經(jīng)未損傷組和脛神經(jīng)損傷組。將建立周圍神經(jīng)損傷模型的Lewis大鼠脛神經(jīng)在其進(jìn)入腓腸肌以上1厘米處橫斷，并造成0.5厘米的神經(jīng)缺損，然后將橫斷神經(jīng)的遠(yuǎn)、近端分別加橡皮帽封閉。脛神經(jīng)損傷組中，又隨機(jī)分為四個實(shí)驗(yàn)組:脛神經(jīng)切斷即刻，皮膚源性前體細(xì)胞直接注射組;肌肉萎縮產(chǎn)生后，培養(yǎng)液注射組;肌肉萎縮產(chǎn)生后，皮膚源性前體細(xì)胞注射組

9、;肌肉萎縮產(chǎn)生后，皮膚源性前體細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞注射組。分別在細(xì)胞移植術(shù)后第4、8、12周，取標(biāo)本，采用免疫熒光染色定性分析皮膚源性前體細(xì)胞以及皮膚源性前體細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞在體內(nèi)表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF、GDNF和CNTF的情況。
　　結(jié)果:與皮膚源性前體細(xì)胞移植入損傷的周圍神經(jīng)中相比，將皮膚源性前體細(xì)胞移植入完整的未損傷的周圍神經(jīng)中，其存活率明顯降低。在損傷的周圍神經(jīng)環(huán)境中，急性損傷后較慢性損傷

10、后移植細(xì)胞存活率高。將皮膚源性前體細(xì)胞和皮膚源性前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞分別移植入離斷脛神經(jīng)的遠(yuǎn)端，術(shù)后不同時間點(diǎn)觀察，兩種細(xì)胞均能在體內(nèi)存活，且在各時間點(diǎn)后者細(xì)胞存活率較前者高。在術(shù)后第4、8、12周取材，兩種細(xì)胞在損傷的周圍神經(jīng)中的存活率隨時間推進(jìn)均明顯下降。在細(xì)胞移植術(shù)后第12周時，皮膚源性前體細(xì)胞和其誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞在損傷的周圍神經(jīng)中均仍然存活，且在體內(nèi)亦均表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF、GDNF和CNTF。

11、>　　結(jié)論:皮膚源性前體細(xì)胞在不同的周圍神經(jīng)環(huán)境中表現(xiàn)出不一樣的細(xì)胞存活率。皮膚源性前體細(xì)胞和其誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞在損傷的周圍神經(jīng)中至少可以存活12周。體外將皮膚源性前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞可以提高移植術(shù)后細(xì)胞在損傷周圍神經(jīng)中的存活率。皮膚源性前體細(xì)胞和其誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞在體內(nèi)均可表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子。今后可在此基礎(chǔ)上研究皮膚源性前體細(xì)胞和其誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞對促進(jìn)神經(jīng)再生、延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的作用。
　　第三部

12、分:皮膚源性前體細(xì)胞及其體外誘導(dǎo)分化成的神經(jīng)元樣細(xì)胞移植延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:研究皮膚源性前體細(xì)胞和皮膚源性前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞移植對失神經(jīng)骨骼肌萎縮的作用。
　　方法:將脛神經(jīng)損傷模型受體組每一只Lewis大鼠脛神經(jīng)在其進(jìn)入腓腸肌以上1厘米處橫斷，并造成0.5厘米的神經(jīng)缺損，然后將橫斷神經(jīng)的遠(yuǎn)、近端分別加橡皮。一周后，隨機(jī)將受體大鼠分為三組，分別注射培養(yǎng)液、皮膚源性前體細(xì)胞、皮膚源性前體細(xì)胞體

13、外誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞。在細(xì)胞移植術(shù)后第4、8、12周先對大鼠行步態(tài)分析，然后分別取腓腸肌和脛神經(jīng)測定腓腸肌張力、肌張力、肌肉橫截面積維持率、神經(jīng)內(nèi)軸突數(shù)量，有髓神經(jīng)纖維密度、G比值等，并對肌肉組織行Mallory三色染色分析其組織纖維化程度。
　　結(jié)果:皮膚源性前體細(xì)胞和皮膚源性前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞移植后均能促進(jìn)腓腸肌萎縮后下肢功能的恢復(fù)。皮膚源性前體細(xì)胞、皮膚源性前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞和對照組相比均能延緩失