大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷后NADPH氧化酶對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元自噬調(diào)節(jié)的分子機(jī)制研究.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury, TBI)是由外力導(dǎo)致腦組織嚴(yán)重受損的疾病，具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率等特點(diǎn)，且患者多數(shù)是青壯年，幸存者大部分遺留有不同程度的神經(jīng)和心理方面的功能障礙，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。但是目前來(lái)講，TBI的治療手段比較有限，因此深入研究TBI后的生理病理機(jī)制改變、尋找新的有效治療靶點(diǎn)一直是TBI研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。
　　 TBI后導(dǎo)致進(jìn)一步腦損害發(fā)生的主要病理

2、機(jī)制是繼發(fā)性腦損傷（Secondary brain injury, SBI），繼發(fā)性腦損傷發(fā)生于受傷后數(shù)分鐘到數(shù)天甚至更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，它是以原發(fā)性損傷為基礎(chǔ)逐漸發(fā)展起來(lái)的病理改變，是造成TBI后神經(jīng)元損傷、乃至死亡的重要原因，因此對(duì)繼發(fā)性腦損傷的治療是改善TBI患者預(yù)后的關(guān)鍵。最近研究證明TBI后由氧自由基尤其超氧陰離子所引起的連鎖反應(yīng)是神經(jīng)元受損的核心病理環(huán)節(jié)。其中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine

3、 dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶是由多個(gè)亞基組成的酶復(fù)合體，在氧化酶正常功能的維持及氧自由基的產(chǎn)生過(guò)程中起著重要作用。NADPH氧化酶參與TBI后繼發(fā)性腦損傷的機(jī)制還未完全闡明。在腦缺血-再灌注研究中發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶在各種因素作用下活性增加產(chǎn)生過(guò)多的活性氧通過(guò)各種細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與腦缺血后神經(jīng)元的死亡。自噬(aut ophagy)性細(xì)胞死亡作為神經(jīng)細(xì)胞死亡的一種新形式，近期越來(lái)越受到關(guān)

4、注，但是其在TBI中的作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)機(jī)制方面研究仍然不足，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腦損傷后是否受到NADPH氧化酶的調(diào)節(jié)目前也不是很明確。
　　 本文擬利用改良的Marmarou方法復(fù)制大鼠彌漫性中度TBI模型，并應(yīng)用NADPH氧化酶特異性抑制劑Apocynin、Akt特異性抑制劑LY294002進(jìn)行預(yù)處理，探討NADPH氧化酶活性與其催化亞單位NOX2蛋白表達(dá)的變化以及其在繼發(fā)性腦損傷中的作用;同時(shí)明確NADPH氧化酶對(duì)海馬神

5、經(jīng)元自噬表達(dá)的影響與其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制，以尋找TBI后引起神經(jīng)元自噬發(fā)生的信號(hào)通路上游中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，為研究TBI后繼發(fā)性腦損害的發(fā)生機(jī)理與臨床治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。本研究論文分共三部分進(jìn)行闡述。
　　 第一部分大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷后NADPH氧化酶活性和其催化亞單位NOX2的表達(dá)變化及在繼發(fā)性腦損傷中的作用
　　 目的:檢測(cè)彌漫性中度TBI大鼠海馬CA1區(qū)NADPH氧化酶活性及其催化亞單位NOX2蛋白的表達(dá)變化，

6、明確NADPH氧化酶在繼發(fā)性腦損傷中的作用。
　　 方法:健康SD雄性大鼠240只數(shù)字隨機(jī)分組:
　　 ①假手術(shù)組(Sham group);
　　 ②腦創(chuàng)傷組(TBI group);
　　 ③腦創(chuàng)傷+溶劑組(DMSO group);
　　 ④腦創(chuàng)傷+Apocynin組(Apocynin group)。
　　 采用改良的Marmarou方法復(fù)制中度TBI模型，于TBI后6h、12h、24 h

7、、48 h、72 h等5個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)下列指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè):
　　 ①HE染色觀察腦組織CA1區(qū)病理形態(tài)學(xué)變化;
　　 ②免疫組化檢測(cè)海馬CA1區(qū)NOX2的蛋白表達(dá)、定位;
　　 ③Western-blot檢測(cè)海馬區(qū)NOX2的蛋白表達(dá);
　　 ④光澤精比色法檢測(cè)海馬區(qū)NADPH氧化酶活性;
　　 ⑤干濕比重法測(cè)定腦組織水含量;
　　 ⑥另取40只SD大鼠于TBI后8、10天行Morris水迷宮測(cè)試

8、，檢測(cè)其空間學(xué)習(xí)記憶能力。
　　 應(yīng)用Image Proplus 6.0和Gel-Doc軟件分析系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行定量，所得數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)變化:海馬CA1區(qū)Sham組組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)

9、細(xì)胞數(shù)較量多，形態(tài)完整;TBI組和DMSO溶劑組神經(jīng)元胞體腫脹明顯，胞漿嗜色性染色減弱，核仁皺縮濃染明顯，細(xì)胞周圍存在較大間隙，出現(xiàn)神經(jīng)元變性壞死等;Apocynin治療組神經(jīng)元胞體腫脹和核仁濃縮較TBI組明顯減輕，神經(jīng)元周圍間隙相對(duì)較小。
　　 2、NOX2免疫組化檢測(cè)結(jié)果:NOX2在海馬CA1區(qū)主要定位于細(xì)胞的胞膜，Sham組偶可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，著色較淺淡;與Sham組相比，TBI后6h起NOX2陽(yáng)性細(xì)胞開(kāi)始增多，著色加深，免疫

10、反應(yīng)性增強(qiáng)，24 h達(dá)高峰，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); DMSO組與TBI組NOX2表達(dá)組間無(wú)差異;Apocynin治療組NOX2陽(yáng)性表達(dá)趨勢(shì)與TBI組和DMSO組相似，但免疫反應(yīng)性明顯減弱（P＜0.05）。
　　 3、海馬區(qū)NOX2蛋白Western-blot檢測(cè)結(jié)果:Sham組NOX2的蛋白有少量表達(dá)，且在各時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯變化;TBI組與Sham組相比NOX2的蛋白表達(dá)量在傷后6h開(kāi)始升高，峰值在TBI后24 h出

11、現(xiàn)，后開(kāi)始下降，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05); DMSO組與TBI組的NOX2表達(dá)組間無(wú)明顯差異，Apocynin治療組各時(shí)間點(diǎn)NOX2蛋白表達(dá)趨勢(shì)與TBI和DMSO組相似，但表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）。
　　 4、海馬區(qū)NADPH氧化酶活性結(jié)果檢測(cè):在Sham組中NADPH氧化酶活性較低，不隨時(shí)間推移而改變;TBI組和DMSO組在TBI后6h起明顯升高，24 h達(dá)到高峰，后開(kāi)始回落，到72 h仍然沒(méi)有降至正常水平，

12、各個(gè)時(shí)間點(diǎn)NADPH氧化酶的活性與Sham組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Apocynin治療組NADPH氧化酶活性變化趨勢(shì)同TBI組，與TBI和 DMSO組相比其活性明顯下降(P＜0.05)。
　　 5、TBI后腦組織水含量測(cè)定:TBI后6h、12h、24 h、48 h、72 h腦組織水含量百分比分別為77.23±0.82、78.51±0.92、80.62±0.79、80.75±1.06、80.92±0.87。DMSO組

13、各時(shí)間點(diǎn)含水量與TBI組相似，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但均明顯高于假手術(shù)組74.62士0.76(P＜0.05);Apocynin干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)水含量較TBI組明顯減少（P＜0.05）。
　　 6、學(xué)習(xí)記憶能力改變:使用Morris水迷宮測(cè)試檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力改變。 TBI組和DMSO組傷后第8天及第10天搜索安全島潛伏期較Sham組均明顯延長(zhǎng)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Apocynin組傷后第8天及第10天搜

14、索安全島運(yùn)動(dòng)軌跡、潛伏期均較TBI和DMSO組明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 小結(jié):TBI后海馬CA1區(qū)NADPH氧化酶催化亞單位NOX2表達(dá)水平上調(diào)，NADPH氧化酶活性增加，加重TBI后繼發(fā)性腦損傷;抑制TBI后NADPH氧化酶的激活可以明顯減輕腦水腫，改善學(xué)習(xí)記憶功能障礙，具有神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 第二部分大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷后NADPH氧化酶對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元自噬的影響
　　 目的:探討

15、TBI后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元是否發(fā)生自噬，并明確NADPH氧化酶是否對(duì)神經(jīng)元自噬的表達(dá)存在影響。
　　 方法:采用改良的Marmarou方法復(fù)制大鼠中度TBI模型。隨機(jī)分組:
　　 ①Sham組(n=45);
　　 ②TBI組(n=45);
　　 ③DMSO組(n=45);
　　 ④Apocynin組(n=45)。
　　 取傷后6h、12h、24 h、48 h、72 h共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)下列指標(biāo)

16、進(jìn)行檢測(cè):
　　 ①免疫組化檢測(cè)海馬CA1區(qū)自噬標(biāo)志性蛋白Beclin-1的表達(dá)、定位;
　　 ②Western-blot檢測(cè)海馬區(qū)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值以及Beclin-1的蛋白表達(dá);
　　 ③熒光雙標(biāo)檢測(cè)海馬CA1區(qū)LC3與神經(jīng)元特異性標(biāo)記物(NeuN)的表達(dá)、定位。定量分析和統(tǒng)計(jì)方法同第一部分。
　　 結(jié)果:
　　 1、海馬CA1區(qū)Beclin-1免疫組化檢測(cè)結(jié)果:Beclin

17、-1主要定位于神經(jīng)元胞質(zhì)，Sham組偶見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，著色淺淡，免疫反應(yīng)性不隨時(shí)間推移而改變。與Sham組比較，TBI組傷后6h起B(yǎng)eclin-1陽(yáng)性細(xì)胞開(kāi)始明顯增多，且著色加深，免疫反應(yīng)性增強(qiáng)，傷后24 h達(dá)高峰，后開(kāi)始下降，DMSO組與TBI組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05); Apocynin治療組Beclin-1表達(dá)趨勢(shì)與TBI組相似，但陽(yáng)性表達(dá)與免疫反應(yīng)性明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2、海馬Be

18、clin-1的Western blot檢測(cè)結(jié)果:Sham組Beclin-1蛋白表達(dá)較低，各時(shí)間點(diǎn)無(wú)變化;與Sham組比較，TBI組傷后6h起B(yǎng)eclin-1蛋白量逐漸增加，傷后24 h達(dá)高峰，后表達(dá)逐漸下降至傷后72 h仍未達(dá)正常水平，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); TBI組與DMSO組比較Beclin-1表達(dá)變化組間無(wú)差異(P＞0.05); Apocynin治療組Beclin-1蛋白表達(dá)時(shí)程變化與TBI組相似，但各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量

19、明顯減少(P＜0.05)。
　　 3、海馬CA1區(qū)LC3的Western blot檢測(cè)結(jié)果:Sham組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值在各時(shí)間點(diǎn)無(wú)變化;與Sham組比較，傷后6h開(kāi)始TBI組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值逐漸升高，24 h達(dá)峰值，后逐漸下降，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;TBI組與DMSO組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;Apocynin治療組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值變化趨勢(shì)與TBI組相似，但比值明顯變小，傷后6h

20、、12h、24 h、48 h和72 h差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4、海馬CA1區(qū)LC3與神經(jīng)元特異性標(biāo)記物(NeuN)熒光雙標(biāo)檢測(cè)結(jié)果:激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)LC3為TRITC標(biāo)記的細(xì)胞核周紅色熒光，NeuN為FITC標(biāo)記的綠色熒光。在TBI組中可見(jiàn)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞胞漿中可見(jiàn)大量綠色和紅色熒光重疊呈黃色聚集，說(shuō)明神經(jīng)元發(fā)生了自噬;Apocynin治療組中紅色熒光和綠色熒光重疊明顯減少，神經(jīng)元自噬表達(dá)受到抑

21、制。
　　 小結(jié):TBI后6h起海馬CA1亞區(qū)神經(jīng)元即可檢測(cè)到自噬現(xiàn)象的發(fā)生，且自噬表達(dá)逐步增強(qiáng)，于TBI后24 h達(dá)峰值;使用Apocynin進(jìn)行預(yù)處理可明顯減輕神經(jīng)元發(fā)生自噬的程度:結(jié)果表明TBI后NADPH氧化酶介導(dǎo)調(diào)控了海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的自噬發(fā)生。
　　 第三部分大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷后NADPH氧化酶對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元自噬調(diào)節(jié)的分子機(jī)制研究
　　 目的:通過(guò)使用NADPH氧化酶與Akt特異性抑制劑Apoc

22、ynin和LY294002進(jìn)行干預(yù)處理，明確TBI后Akt/mTOR信號(hào)通路是否參與了NADPH氧化酶介導(dǎo)調(diào)控的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的自噬發(fā)生。
　　 方法:將270只SD大鼠隨機(jī)分成6組:
　　 ①Sham組；
　　 ②Sham+LY294002組；
　　 ③TBI組；
　　 ④DMSO組；
　　 ⑤Apocynin組；
　　 ⑥Apocynin+LY294002組。
　　

23、 每組又分別劃分為傷后6h、12h、24 h、48 h、72 h等5個(gè)時(shí)間點(diǎn)。檢測(cè)：
　　 ①HE染色觀察海馬CA1區(qū)組織形態(tài)改變;
　　 ②Western blot半定量檢測(cè)P-Aktser-473、 p-P70S6KThr-389、 Beclin-1、 LC3的蛋白表達(dá);
　　 ③熒光顯微鏡檢測(cè)LC3、p-AktThr-389分別與神經(jīng)元特異性標(biāo)記物(NeuN)雙標(biāo)定位。
　　 結(jié)果分析和統(tǒng)計(jì)方法同前

24、。
　　 結(jié)果:
　　 1、HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)改變:光鏡下Sham組和TBI組腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)同前;Apocynin聯(lián)合LY294002治療組在TBI后24 h可見(jiàn)病理形態(tài)改變較TBI組明顯加重，神經(jīng)元胞體腫脹明顯，壞死，胞漿嗜色性染色減弱與核仁皺縮濃染更加明顯。
　　 2、海馬區(qū)p-Aktser-473的Western blot檢測(cè)結(jié)果:Sham組p-Aktser-473蛋白表達(dá)較低，在各時(shí)間點(diǎn)無(wú)變化，與Sh

25、am組比較，TBI組傷后6h起p-Aktser-473蛋白量顯著增高（P＜0.05），6 h-24 h表達(dá)逐漸下降，24 h后表達(dá)又緩慢增強(qiáng)呈雙峰狀，Apocynin組各時(shí)間點(diǎn)p-Aktser-473蛋白表達(dá)趨勢(shì)變化與TBI組相似，但表達(dá)量顯著增加，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3、海馬區(qū)p-P70S6KThr-389的Western blot檢測(cè)結(jié)果:Sham組p-P70S6KThr-389蛋白表達(dá)較低，不隨時(shí)

26、間推移而改變;與Sham組相比， TBI組傷后6h起p-P70S6KThr-389蛋白量顯著增高(P＜0.05)，6 h-24 h表達(dá)逐漸下降，24 h后表達(dá)又緩慢增強(qiáng)呈雙高峰表達(dá)，Apocynin組各時(shí)間點(diǎn)p-P70S6KThr-389蛋白表達(dá)趨勢(shì)變化與TBI組相似，但表達(dá)量顯著增加。
　　 4、海馬區(qū)Beclin-1的Western blot檢測(cè)結(jié)果:Sham+LY294002組與Sham組相比Beclin-1蛋白表達(dá)相應(yīng)時(shí)

27、間點(diǎn)無(wú)明顯差異。TBI組與Sham組比較，傷后6h起B(yǎng)eclin-1逐漸增加，傷后24 h達(dá)峰值，后逐漸下降;Apocynin治療組Beclin-1蛋白表達(dá)趨勢(shì)與TBI組相似，但表達(dá)量顯著減少，Apocynin+LY294002組與TBI組比較，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)Beclin-1蛋白表達(dá)明顯增加，組間差異均有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 5、海馬區(qū)LC3的Western blot檢測(cè)結(jié)果:Sham+LY294002組與Sham組

28、相比LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值無(wú)明顯差異;與Sham組比較，TBI組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值于TBI后6h開(kāi)始升高，于24 h達(dá)峰值，后表達(dá)逐漸下降;Apocynin組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值變化趨勢(shì)與TBI組相似，但比值明顯變小(P＜0.05);Apocynin+LY294002組與TBI組比較，各時(shí)間點(diǎn)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯增加(P＜0.05)。
　　 6、LC3與海馬CA1區(qū)NeuN熒光雙標(biāo)檢測(cè)結(jié)果:激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)L

29、C3為TRITC標(biāo)記的紅色熒光，NeuN為FITC標(biāo)記的綠色熒光。TBI組中可見(jiàn)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞胞漿中可見(jiàn)大量綠色和紅色熒光重疊呈黃色聚集，證明神經(jīng)元發(fā)生了自噬;Apocynin治療組中紅色熒光和綠色熒光重疊明顯減少，神經(jīng)元自噬程度減弱;Apocynin聯(lián)合LY294002治療組紅色熒光和綠色熒光重疊明顯增加，神經(jīng)元自噬程度增強(qiáng)。
　　 7、P-Aktser-473與海馬CA1區(qū)NeuN熒光雙標(biāo)檢測(cè)結(jié)果:激光共聚焦顯微鏡下

30、可見(jiàn)p-Aktser-473為TRITC標(biāo)記的紅色熒光，NeuN為FITC標(biāo)記的綠色熒光。在TBI組中可見(jiàn)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞胞漿中可見(jiàn)大量綠色和紅色熒光重疊呈黃色聚集;Apocynin治療組中紅色熒光和綠色熒光重疊明顯增加，說(shuō)明Apocynin通過(guò)抑制NADPH氧化酶而上調(diào)了海馬CA1區(qū)神經(jīng)元p-Aktset-473的表達(dá)。
　　 小結(jié):大鼠發(fā)生彌漫性TBI后，NADPH氧化酶活性增加，抑制了氧化應(yīng)激上調(diào)的Akt/mTOR信