一種合理設(shè)計的新型低分子肝素的制備及體內(nèi)外活性評價.pdf

1、目前市場上的抗凝藥物主要包括肝素類、香豆素類。肝素類藥物自上世紀(jì)40年代以來被廣泛應(yīng)用于抗凝和預(yù)防血栓形成，其臨床應(yīng)用價值至今仍是任何一種藥物都無法代替的。肝素類抗凝藥物主要包括普通肝素(heparin，HP)，低分子肝素(lowmolecularweightheparin，LMWH，例如依諾肝素鈉)，超低分子肝素(ultralowmolecularweightheparin，ULMWH)，化學(xué)合成的肝素類似物。
　　 肝素類藥

2、物的合理設(shè)計(rationaldesign)是基于對肝素類的結(jié)構(gòu)和抗凝功能關(guān)系的深入理解而提出的。肝素由于分子量較大，以及在多糖的組成和多糖鏈的長度上具有多分散性，從而導(dǎo)致了它的出血副作用、皮下注射生物利用度低、藥代動力學(xué)特征難以預(yù)測、用藥個體差異大等缺點。現(xiàn)有的LMWH和肝素戊糖則有不能被硫酸魚精蛋白(protaminesulphate，PS)有效中和的缺點。如果控制肝素組分的高抗凝活性組分的含量和分子鏈的長度、多分散度(polydi

3、spersity，P.D.)，則有可能研制出性能更為優(yōu)越的合理設(shè)計的新型低分子肝素(rationallydesignedlowmolecularweightheparin，RD-LMWH)。即RD-LMWH應(yīng)具有合適的分子量以保持高抗凝活性，同時具有可以皮下給藥的優(yōu)點;應(yīng)具有較集中的分子量分布即較小的P.D.，使其藥動學(xué)特點更好預(yù)測;RD-LMWH還應(yīng)具備可以被PS有效中和的特點。
　　 肝素類具有抗FIIa活性至少需要18個單

4、糖，即分子量至少為5400Da，而要具有比較小的P.D.，則需要制備得到的RD-LMWH的分子量分布比較窄。實驗設(shè)計截取5400Da-9000Da之間的組分。依諾肝素鈉(enoxaparinsodium)為目前最暢銷的LMWH，為堿性β-消除降解法制備的LMWH，且β-消除降解法制備LMWH對樣品硫酸根基團破壞小，能較好的保留肝素的高抗凝活性，β-消除降解法的反應(yīng)所需試劑在終產(chǎn)物中無殘留，是一種比較好的LMWH制備方法。實驗用β-消除降

5、解法優(yōu)化后的條件制備得到的LMWH記為β-LMWH;從β-LMWH經(jīng)BioGelP-10分離后截取的分子量在5400Da-9000Da之間的組分，記為RD-LMWH;得到的分子量＞9000Da的大分子組分記為LMWH-A;分子量＜5400Da的小分子組分記為LMWH-B。用HP及enoxaparin分別作為對照，對RD-LMWH進行結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析，體外活性評價，體內(nèi)抗血栓活性評價，藥代動力學(xué)測定。
　　 本研究取得的結(jié)果和結(jié)

6、論有以下幾個方面:
　　 1.RD-LMWH的制備及分離純化
　　 通過優(yōu)化堿性p消除降解的成鹽、成酯、堿解條件，建立了用β消除法結(jié)合凝膠層析法制備符合要求的RD-LMWH的方法，總收率為12.3％。制備的RD-LMWH與HP、enoxaparin用GPC-HPLC方法測得的分子量性質(zhì)如下:
　　 RD-LMWH的Mp為6570Da，Mw為6550Da，P.D.(Mw/Mn)為1.052，5400Da～9000D

7、a(％)之間的組分所占比例為76.5％;HP的Mp約為15000Da，Mw約為15000Da，P.D.(Mw/Mn)約為1.5;enoxaparin的Mp為2896Da，Mw為4148Da，P.D.(Mw/Mn)為1.279。
　　 RD-LMWH在分子量上5400Da-9000Da之間的組分占76.5％，符合實驗設(shè)計的要求。分子量分布上，制備得到的RD-LMWHP.D.(1.052)接近于1，P.D.低于HP(P.D.約1.5

8、)和enoxaparin(P.D.為1.28)，符合實驗設(shè)計的要求。
　　 2.RD-LMWH的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析
　　 通過對樣品進行雙糖組成分析和核磁共振光譜(1H-NMR)，確證了RD-LMWH的主要雙糖結(jié)構(gòu)仍為三硫酸雙糖。通過紫外光譜、紅外光譜、基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜分析，確證了其結(jié)構(gòu)與堿性β-消除降解之前的HP原料及enoxaparin基本相同。
　　 應(yīng)用多角度激光散射測定分子量。RD-LMWH

9、的Mp為6989Da(0.3％)，Mw為6751Da(0.4％);HP的Mp16079Da(0.2％),Mw為16650(0.3％);enoxaparinMp3735Da(0.2％)，Mw為4244Da(0.5％)。測得結(jié)果與GPC-HPLC方法基本一致。
　　 測定了樣品的部分理化性質(zhì)。樣品硫酸根含量測定結(jié)果:RD-LMWH為27.8％，HP為28.4％，enoxaparin為27.3％，LMWH-A為27.9％，LMWH-B

10、為26.8％，β-LMWH為27.5％。硫酸根/羧酸根比值:RD-LMWH為1.97∶1，HP為2.05∶1,enoxaparin為1.92∶1,LMWH-A為1.95∶1,LMWH-B為1.88∶1,β-LMWH為1.94∶1。RD-LMWH與堿性β-消除降解之前的HP原料及enoxaparin基本一致。比旋度測定結(jié)果:RD-LMWH為+50.29°，HP為+50.98°，enoxaparin為+43.63°，LMWH-A為+52.5

11、8°，LMWH-A為+52.58°，RD-LMWH為+51.96°，符合肝素類的比旋度質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。堿性β-消除降解法制備的LMWH理化性質(zhì)變化不大。
　　 3.RD-LMWH的體外活性評價
　　 羊血漿法測定RD-LMWH的抗凝血效價為173.2+0.4IU/mg，HP為204IU/mg,enoxaparin為33.9±0.3IU/mg,LMWH-A為180.1±0.7IU/mg,LMWH-B為23.4±0.12IU/mg

12、,β-LMWH為138.6±0.4IU/mg。
　　 生色底物法測定RD-LMWH抗FXa活性為166.5IU/mg，HP為193.2IU/mg，enoxaparin為118.7IU/mg。生色底物法測定RD-LMWH抗FIIa效價為159.6IU/mg，HP為190.3IU/mg，enoxaparin為31.9IU/mg。RD-LMWH的抗FXa、抗FIIa、抗FXa/FIIa效價的性質(zhì)都接近HP原料。
　　 PS的效

13、價通常以可以中和HP的抗凝血效價計。對PS中和RD-LMWH、HP、enoxaparin的抗FXa效價程度進行了測定。抗FXa效價，在PS:樣品抗FXa效價為1∶1時，RD-LMWH的68％可以被中和，HP的抗FXa效價96％可以被中和，而enoxaparin只有23％可以被中和。在PS:樣品抗FXa效價為3∶1時，RD-LMWH的89％可以被中和，HP的抗FXa效價可以98％被中和，而enoxaparin只有30％的可以被中和。

14、>　　 對PS中和RD-LMWH、HP、enoxaparin的的抗FIIa效價程度進行了測定。在PS:樣品抗FIIa效價比為1∶1時時，RD-LMWH的87％可以被中和，HP的抗FIIa效價92％可以被中和，而enoxaparin87％可以被中和。在PS:樣品抗FIIa效價比為3∶1時，RD-LMWH的97.2％可以被中和，HP的抗FIIa效價可以97.5％被中和，enoxaparin97.1％可以被中和。
　　 PS可以中和

15、抗FXa和抗FIIa效價的程度排序為HP＞RD-LMWH＞enoxaparin，即RD-LMWH出血情況時，被PS中和的效率高于enoxaparin，因而更安全。
　　 4.RD-LMWH的體內(nèi)抗血栓活性評價
　　 采用大鼠體內(nèi)頸動脈血栓模型，測定了RD-LMWH等對血栓濕重、血漿APTT和血漿PT的影響。實驗設(shè)生理鹽水(saline，SA)組、HP組(3mg/kg)、enoxaparin組(3mg/kg)、RD-LMW

16、H組(1mg/kg)、RD-LMWH組(3mg/kg)、RD-LMWH組(5mg/kg)。結(jié)果如下:
　　 血栓濕重比較:(1)HP組，enoxaparin組，RD-LMWH組(3mg/kg、5mg/kg)與SA比較，血栓濕重較SA組輕(P＜0.05)。RD-LMWH組(1mg/kg)與SA組比較(P＞0.05)。(2)所有組與HP相比較，血栓濕重高于HP組(P＜0.05)。(3)RD-LMWH樣品組與enoxaparin組相比

17、較，RD-LMWH組(1mg/kg)血栓濕重高于enoxaparin組(P＜0.05)，RD-LMWH組(3mg/kg)血栓濕重低于enoxaparin組(P＞0.05)，RD-LMWH組(5mg/kg)血栓濕重低于enoxaparin組(P＜0.05)。(4)RD-LMWH樣品組，對血栓濕重的抑制率，有劑量依賴性。RD-LMWH(1mg/kg)與RD-LMWH(3mg/kg)，RD-LMWH(1mg/kg)與RD-LMWH(5mg/k

18、g)差異顯著(P＜0.05)。
　　 APTT比較:(1)與SA組比較，所有組的APTT較SA短(P＜0.05)。(2)所有組與HP組相比較，APTT短于HP組(P＜0.05)。(3)樣品組與enoxaparin組比較，RD-LMWH組(1mg/kg)APTT長于enoxaparin組(P＜0.05)，RD-LMWH組(3mg/kg、5mg/kg)APTT長于enoxaparin組(P＜0.05)。(4)RD-LMWH樣品組，對

19、APTT的延長作用有劑量依賴性，劑量越高，延長作用越明顯。RD-LMWH組(1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg)相互之間差異顯著(P＜0.05)。
　　 PT比較:(1)HP組，enoxaparin組，RD-LMWH(1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg)分別與SA比較，PT較SA短，差異顯著(P＜0.05)。(2)所有組與HP組比較，PT短于HP組(P＜0.05)。(3)RD-LMWH樣品組與enoxaparin組比

20、較，RD-LMWH組(1mg/kg)PT長于enoxaparin組(P＞0.05)，RD-LMWH組(3mg/kg、5mg/kg)PT長于enoxaparin組(P＜0.05)。(4)RD-LMWH樣品組，對PT的延長作用有劑量依賴性，RD-LMWH組(1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg)相互之間差異顯著(P＜0.05)。
　　 采用大鼠體內(nèi)下腔靜脈血栓模型，測定了RD-LMWH等血栓濕重、該模型大鼠APTT和PT的影響。

21、實驗設(shè)SA組、HP組(3mg/kg)、enoxaparin組(3mg/kg)、RD-LMWH組(1mg/kg)、RD-LMWH組(3mg/kg)、RD-LMWH組(5mg/kg)。
　　 結(jié)果如下:
　　 血栓濕重:(1)與SA組比較，HP組，enoxaparin組，RD-LMWH組(1mg/kg，3mg/kg，5mg/kg)與SA比較，血栓濕重較SA輕(P＜0.05)。(2)RD-LMWH所有組與HP相比較，血栓濕重高

22、于HP組(P＜0.05)。(3)RD-LMWH樣品組與enoxaparin組相比較，RD-LMWH組(1mg/kg)血栓濕重高于enoxaparin(P＞0.05)，RD-LMWH組(3mg/kg)血栓濕重低于enoxaparin組(P＞0.05)，RD-LMWH組(5mg/kg)血栓濕重低于enoxaparin組(P＜0.05)。(4)RD-LMWH樣品組對血栓濕重的抑制率，有劑量依賴性。樣品之間兩兩比較，RD-LMWH(1mg/kg

23、)與RD-LMWH(3mg/kg)，RD-LMWH(1mg/kg)與RD-LMWH(5mg/kg)差異顯著(P＜0.05)。
　　 Wessler評分比較:(1)與SA比較，HP組，enoxaparin組，RD-LMWH(1mg/kg)，RD-LMWH(3mg/kg)，RD-LMWH(Smg/kg)與SA比較，Wessler評分較SA組低(P＜0.05)。(2)所有組與HP組相比較，wessler評分高于HP組(P＜0.05)。

24、(3)RD-LMWH樣品組與enoxaparin組相比較，RD-LMWH組(1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg)的wessler評分低于enoxaparin組(P＞0.05)。(4)RD-LMWH樣品組對wessler評分的影響，有劑量依賴性，劑量越高，評分越低。RD-LMWH(1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg)的wessler評分相互之間差異不顯著(P＞0.05)。
　　 APTT比較:(1)與SA組比較，HP組

25、，RD-PLMWH組(1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg)比SA組APTT長(P＜0.05);enoxaparin組比SA組APTT長(P＞0.05)。(2)所有組與HP相比較，APTT短于HP組(P＜0.05)。(3)RD-LMWH樣品組與enoxaparin組比較，RD-LMWH組(1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg)的APTT長于enoxaparin組(P＜0.05)。(4)RD-LMWH樣品組，對APTT的延長作用有

26、劑量依賴性，劑量越大，延長作用越明顯。RD-LMWH組(1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg)APTT相互之間差異顯著(P＜0.05)。
　　 PT比較:(1)與SA組比較，HP，RD-LMWH(3mg/kg，5mg/kg)比SA組PT長(P＜0.05);enoxaparin，RD-LMWH(1mg/kg)比SA組PT長(P＞0.05)。(2)所有組與HP組相比較，PT短于HP組(P＜0.05)。(3)RD-LMWH樣品組與

27、enoxaparin組比較，RD-LMWH(1mg/kg)PT長于enoxaparin組(P＞0.05)，RD-LMWH(3mg/kg，5mg/kg)PT顯著長于enoxaparin組(P＜0.05)。(4)樣品組，對PT的延長作用有劑量依賴性，劑量越大，延長作用越明顯。RD-LMWH(1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg)的PT相互之間差異顯著(P＜0.05)。
　　 5.RD-LMWH的藥代動力學(xué)研究
　　 用新

28、西蘭兔進行了體內(nèi)藥動學(xué)測定。RD-LMWH和enoxaparin采用皮下給藥，HP為靜脈給藥，給藥量均為3mg/kg。以抗FXa活性為檢測指標(biāo)，用DAS2.0藥動學(xué)軟件進行計算，得到以下結(jié)果:
　　 RD-LMWHt1/2為3.1+0.788h,AUC(0-t)(IU/L*h)為4.1±0.474,Tmax為3.667±0.816h,Cmax為0.49±0.047(IU/mL);HP的t1/2為0.606±0.187h,AUC(

29、0-t)為6.343±1.467(IU/L*h)，Tmax為0.167h，Cmax為5.29±0.638(IU/mL);enoxaparint1/2為3.971±1.029h,AUC(0-t)為3.675±0.37(IU/L*h),Tmax為2.667±1.033h,Cmax為0.397±0.029(IU/mL)。
　　 實驗同時測定了不同樣品在不同時間點的兔血漿APTT、PT。
　　 表明Tmax:RD-LMWH＞en

30、oxaparin＞HP，RD-LMWH由于分子量較大，達峰時間較enoxaparin長，HP為靜脈給藥血藥濃度達峰時間最短。t1/2:enoxaparin＞RD-LMWH＞HP。由AUC(0-t)和Cmax可以看出RD-LMWH可以達到治療所需的血藥濃度，達到最初的設(shè)計的目的。
　　 6.課題總結(jié)及創(chuàng)新性
　　 (1)建立了堿性β-消除降解法結(jié)合凝膠層析法制備合理設(shè)計的RD-LMWH的方法。
　　 (2)對所制備

31、的RD-LMWH進行了結(jié)構(gòu)分析和理化性質(zhì)分析，并設(shè)HP、enoxaparin為對照，表明所得RD-LMWH符合設(shè)計要求。
　　 (3)對所制備的RD-LMWH進行了抗凝活性、抗FXa活性和抗FIIa活性測定，并設(shè)HP、enoxaparin為對照。結(jié)果表明RD-LMWH的抗FXa和抗FIIa活性均較高，RD-LMWH的抗FXa∶抗FIIa活性約為1∶1，HP抗FXa∶抗FIIa活性約為1∶1，enoxaparin抗FXa∶抗FII

32、a活性約為3.5∶1，可見RD-LMWH在抗凝活性方面的性質(zhì)較接近于HP。測定了RD-LMWH被PS中和程度，同時以HP和enoxaparin為對照，結(jié)果表明RD-LMWH的抗FXa和抗FIIa被PS中和的程度更接近于HP，優(yōu)于enoxaparin。
　　 (4)對所制備的RD-LMWH通過血栓濕重、APTT、PT等為檢測指標(biāo)，對其抗動脈血栓和抗靜脈血栓的效果進行了評價，并設(shè)HP、enoxaparin為對照。結(jié)果表明RD-LMW