一種新型抗菌活性多糖的研究.pdf

1、抗生素與化學(xué)殺菌劑濫用等原因造成耐藥菌快速出現(xiàn)和廣泛傳播,對(duì)人類(lèi)的生命健康造成了嚴(yán)重威脅。不斷研究開(kāi)發(fā)新型的廣譜、高效、安全的生物殺菌劑來(lái)有效地控制日益嚴(yán)重的耐藥菌感染是人們必須要解決的重要課題。
　　本課題組從湖北省大別山區(qū)土壤中篩選到一株的鏈霉菌(Streptomyces)。該菌株能產(chǎn)生一種胞外多糖,這種多糖具有獨(dú)特的抗菌活性。本文從產(chǎn)多糖鏈霉菌的分類(lèi)鑒定、多糖的制備與理化性質(zhì)分析、多糖的結(jié)構(gòu)分析、產(chǎn)多糖培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝優(yōu)化、

2、抗菌活性、抗菌機(jī)理及其應(yīng)用方面展開(kāi)了較為系統(tǒng)的研究,取得的研究成果如下:
　　(1)從菌種的形態(tài)、生理生化、培養(yǎng)特征、細(xì)胞壁組成以及分子分類(lèi)等方面對(duì)產(chǎn)多糖菌株H03進(jìn)行分類(lèi)鑒定,確定其在分類(lèi)學(xué)上的地位。結(jié)果表明,所篩選的菌株H03為典型的鏈霉菌,其生理生化特征與模式菌株白色鏈霉菌相同,而且具有I型細(xì)胞壁,符合鏈霉菌屬(Streptomyces)的化學(xué)分類(lèi)特性,將其與放線(xiàn)菌中各屬的典型菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。發(fā)現(xiàn)它和St

3、reptomyces virginae ATCC20313的相似性最高,因此,將其歸屬于維吉尼亞鏈霉菌,并命名為Streptomyces virginaeH03。菌株的16srDNA部分堿基序列保存在GenBank database中,其編號(hào)為DQ989584,并保藏在菌種保藏中心(中國(guó),武漢),其編號(hào)為CCTCC M207049。
　　(2)研究了抗菌活性多糖的分離純化工藝,利用鹽析法去掉蛋白質(zhì)后,采用乙醇沉淀法獲得粗多糖,然后

4、利用透析法除去小分子物質(zhì),最后通過(guò)凝膠層析獲得多糖純品,最后對(duì)其進(jìn)行純度、理化性質(zhì)以及毒性等方面進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,該活性多糖為灰白色粉末,溶于水,不溶于乙醇、乙醚、丙酮等有機(jī)溶劑;純化后的樣品通過(guò)紫外光譜分析不含蛋白質(zhì)等雜質(zhì);硫酸-苯酚法測(cè)得多糖含量為96.2％,而且小鼠經(jīng)口毒性試驗(yàn)和細(xì)胞毒性試驗(yàn)表明該多糖是安全的。
　　(3)采用凝膠過(guò)濾法測(cè)定多糖的相對(duì)分子質(zhì)量、GC-MS檢測(cè)多糖的單糖組成、高碘酸氧化、Smith降解、NM

5、R等技術(shù)分析各種多糖的單糖連接方式、組成結(jié)構(gòu)單元等。結(jié)果表明,該活性多糖的相對(duì)平均分子質(zhì)量為3.76×104D,其單糖組成為甘露糖、葡萄糖和半乳糖,三種單糖的摩爾比例大約是2:1:1,其可能的結(jié)構(gòu)式為:
　　(4)利用單因素分析、響應(yīng)面法以及正交設(shè)計(jì)法來(lái)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件,確定最佳的發(fā)酵工藝,最后通過(guò)發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明,較為適合的培養(yǎng)基配方為:葡萄糖3.2%、淀粉2%、(NH4)2SO40.33%、黃豆餅粉0.28

6、%、NaCl0.2%、MgSO40.4%、K2HPO40.4%和0.03%CaCO3,初始pH7.4~7.6。發(fā)酵工藝條件為:種齡為48h,接種量為10%,溫度30℃,發(fā)酵周期為120~144 h,攪拌器轉(zhuǎn)速為250rpm。發(fā)酵罐驗(yàn)證的結(jié)果表示,優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝有利于鏈霉菌積累多糖,最大多糖產(chǎn)量可達(dá)27.9g/L。
　　(5)研究了多糖抗病原細(xì)菌、真菌的活性,并對(duì)其抗細(xì)菌機(jī)理進(jìn)行了深入探討。結(jié)果表明,該鏈霉菌多糖的抗菌

7、譜較廣,對(duì)多種病原細(xì)菌、植物病原真菌以及酵母都有較強(qiáng)的抗菌活性,沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌的選擇性抗菌活性。該多糖的抗細(xì)菌機(jī)理在于能破壞金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的細(xì)胞壁,引起細(xì)胞膜的通透性增加或破裂,導(dǎo)致胞內(nèi)可溶性蛋白及其他物質(zhì)外漏,還能破壞胞內(nèi)的DNA結(jié)構(gòu),最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此外,該鏈霉菌多糖具有較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。
　　(6)多糖的應(yīng)用結(jié)果表明,該多糖在油菜菌核病防治、醬油保鮮以及魔芋軟腐病的防治等方面具有非常好