富自體CGF纖維蛋白膜對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞黏附及增殖的影響.pdf

1、目的:富自體濃縮生長(zhǎng)因子（Concentrated Growth Factors，CGF）纖維蛋白為新一代的血液提取物，為自體血經(jīng)不間斷差速離心制備而成的富含多種高濃度生長(zhǎng)因子的纖維蛋白，能夠促進(jìn)骨組織及軟組織的再生和修復(fù)。本研究旨在采用掃描電鏡及HE染色，觀察體外培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞在CGF膜表面的黏附及增殖，為CGF應(yīng)用于牙周組織重建及其進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.人牙齦成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定切取河

2、北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科門(mén)診阻生牙拔除患者正常牙齦組織，患者年齡18-25歲。組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)，培養(yǎng)液選用含20％胎牛血清的低糖DMEM，待細(xì)胞長(zhǎng)至覆蓋瓶底的80％時(shí)，0.25％胰蛋白酶消化傳代。取第2代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人牙齦成纖維細(xì)胞，采用鼠抗人波形蛋白(Vimentin)、角蛋白抗體(cytokeratin)進(jìn)行鑒定。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組及材料準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)分三組:CGF膜組、Bio-gide膜組及空白組CGF膜制備:9 ml

3、 Vacuette真空采血管采取患者靜脈血，立即置入Medifuge離心機(jī)，離心13分鐘后，可見(jiàn)采血管中血液分為三層，棄除上層血清，自中間層及底層交界處剪開(kāi)，壓膜模具將留取的中段CGF纖維蛋白層凝膠壓制成膜。修剪CGF膜至5×5 mm大小，置于無(wú)菌生理鹽水中備用。
　　Bio-gide膜修剪為5×5 mm大小，置于無(wú)菌生理鹽水備用。
　　3.人牙齦成纖維細(xì)胞接種培養(yǎng)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代人牙齦成纖維細(xì)胞，制備成5×104/m

4、l單細(xì)胞懸液，分別接種于CGF膜及Bio-gide膜表面，空白組滴加等量的細(xì)胞懸液。加入含20％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5％CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液一次。
　　4.組織學(xué)觀察
　　接種培養(yǎng)5天，分別取出CGF膜及Bio-gide膜，PBS沖洗，10％福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，組織學(xué)觀察。
　　5.掃描電鏡觀察接種培養(yǎng)5天，分別取出CGF膜及Bio-gide膜，PBS沖洗

5、，2.5％戊二醛固定，脫水，臨界點(diǎn)干燥，噴金鍍膜，掃描電子顯微鏡(scanning electronmicroscopy, SEM)觀察。
　　6.人牙齦成纖維細(xì)胞增殖活性MTT檢測(cè)分別于接種培養(yǎng)2天、5天，酶聯(lián)免疫標(biāo)記儀上490 nm處測(cè)定各組細(xì)胞吸光度OD值。每組設(shè)8個(gè)平行試樣，計(jì)算各組吸光度均值（以(x)±s表示）。
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用單因素方差分析比較三組吸光度

6、值，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.人牙齦成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定原代培養(yǎng)6天，倒置顯微鏡下觀察:可見(jiàn)細(xì)胞自組織塊周邊生長(zhǎng)，細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，胞質(zhì)向外伸出2～3個(gè)突起，胞體豐滿(mǎn)，胞漿均勻，胞核圓形或卵圓形，核仁大。12-14天后細(xì)胞開(kāi)始融合，以組織塊為中心呈放射狀、漩渦狀生長(zhǎng)。采用第2代人牙齦成纖維細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，人牙齦成纖維細(xì)胞抗Vimentin染色陽(yáng)性，胞漿呈棕黃色著色;抗cytokeratin染色陰

7、性。
　　2.組織學(xué)觀察
　　CGF膜組:表面細(xì)胞形態(tài)清晰，胞體豐滿(mǎn)，核大，核仁深染，向膜深層長(zhǎng)入。
　　Bio-gide膜組:表面胞體皺縮，核小，位于膜表層。
　　3.掃描電鏡觀察CGF膜組:表面細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，疊層狀生長(zhǎng)，胞體豐滿(mǎn)，片狀偽足相互連接。
　　Bio-gide膜組:表面細(xì)胞分散生長(zhǎng)，數(shù)量較少，細(xì)胞長(zhǎng)梭形，胞體小，部分細(xì)胞呈扁平狀，細(xì)小的偽足黏附于纖維間，少部分細(xì)胞可見(jiàn)到細(xì)胞間連接。

8、　　4.人牙齦成纖維細(xì)胞增殖活性MTT檢測(cè)接種培養(yǎng)2天，各組吸光度均值（以(x)±s表示）:CGF膜組，0.596±0.049; Bio-gide膜組，0.601±0.035;空白組，0.575±0.014;三組吸光度值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　接種培養(yǎng)5天，三組細(xì)胞吸光度均值（以(x)±s表示）: CGF膜組，0.853±0.031;Bio-gide膜組，0.733±0.027;空白組，0.634±0.013，三組吸光