藻酸鍶凝膠的理化性質(zhì)及其復(fù)合兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外三維培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:研究新型藻酸鍶凝膠(Alg-Sr)的理化性質(zhì),觀察并檢測(cè)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)于藻酸鍶凝膠(Alg-Sr)中的存活、增殖及成骨分化情況,為復(fù)合 BMSCs的 Alg-Sr應(yīng)用于骨的再生及修復(fù)提供理論依據(jù)。
　　方法:(1)制備0.2mol/L的氯化鍶膠凝液(SrCl2),將其與2.0wt％的藻酸鈉溶液交聯(lián)形成 Alg-Sr,肉眼觀察其大體形態(tài),掃描電鏡(SEM)觀察其微觀結(jié)構(gòu)并測(cè)量其壓縮模量、降解率及溶脹率,并將其

2、與同樣方法及濃度制備的藻酸鈣凝膠(Alg-Ca)對(duì)比。
　　(2)全骨髓法獲取兔 BMSCs,體外擴(kuò)增培養(yǎng)并行免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定;
　　(3)將第5代兔 BMSCs以細(xì)胞密度為5105/ml接種于 Alg-Sr中行三維培養(yǎng),每日觀察凝膠中細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài),行 Live/Dead細(xì)胞染色測(cè)定細(xì)胞活力,DNA定量分析細(xì)胞的增殖情況,并設(shè) BMSCs接種于 Alg-Ca中以同樣方法培養(yǎng)作為對(duì)照組。
　　(4)BMSCs分別接種

3、于 Alg-Sr和 Alg-Ca中成骨誘導(dǎo)后,通過檢測(cè)細(xì)胞分泌的 ALP活性,熒光定量 PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因 OSX、Collagen I、Runx2的 mRNA表達(dá)情況,茜素紅及馮庫(kù)染色檢測(cè)鈣鹽沉積情況。
　　結(jié)果:(1)大體觀察上來看,Alg-Sr和 Alg-Ca均為直徑約3mm的白色透明凝膠珠,將它們浸入培養(yǎng)基中數(shù)分鐘后凝膠均呈橙黃色;SEM觀察發(fā)現(xiàn) Alg-Sr與 Alg-Ca均形成典型的“雞蛋盒”樣結(jié)構(gòu),孔隙大小均勻;

4、測(cè)得 Alg-Sr的壓縮模量為(186.53±8.37)kPa,大于 Alg-Ca的(152.14±7.45)kPa,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.863,P<0.05);Alg-Sr與 Alg-Ca的體外降解率于前20天無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),第20、25、30天,Alg-Sr的降解率顯著低于 Alg-Ca(P<0.05);Alg-Sr和 Alg-Ca的溶脹率分別為14.32%±1.53%和15.25%±1.64%,兩者間差異無統(tǒng)計(jì)

5、學(xué)意義(t=0.927,P>0.05)。
　　(2)通過全骨髓培養(yǎng)法及換液、傳代,并通過細(xì)胞形態(tài)及免疫細(xì)胞熒光鑒定結(jié)果 CD29(+)、CD34、CD44(+)、CD45表明成功獲得兔 BMSCs。
　　(3)兔 BMSCs于 Alg-Sr和 Alg-Ca中三維培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)和增殖趨勢(shì)均相似,接種初期(1~4天)細(xì)胞懸浮于凝膠內(nèi)成圓球形散在分布,約4天后細(xì)胞逐漸黏附于凝膠內(nèi)壁呈星形或多角形生長(zhǎng),并逐漸形成大量細(xì)胞集落;兔

6、 BMSCs于 Alg-Sr中三維培養(yǎng)21天時(shí) DNA含量為(4.38±0.24)g,顯著高于 Alg-Ca中的(3.25±0.21)g,(t=7.923,P<0.05)。
　　(4)BMSCs于 Alg-Sr和 Alg-Ca兩種凝膠中成骨誘導(dǎo)12天后,Alg-Sr中 ALP活性為(2.14±0.11)金氏單位/100 mL,Alg-Ca中為(1.69±0.14)金氏單位/100 mL(t=5.652,P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

7、意義(t=5.652,P<0.05);Alg-Sr中的細(xì)胞表達(dá)的 OSX、Collagen I、Runx2的 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高于 Alg-Ca組(P<0.05);Alg-Sr來源的 BMSCs成骨誘導(dǎo)21天后行茜素紅染色及馮庫(kù)染色后,其鈣結(jié)節(jié)數(shù)量和磷酸鹽沉積面積均高于 Alg-Ca來源的細(xì)胞組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:Alg-Sr與 Alg-Ca有相似的均勻孔隙結(jié)構(gòu),BMSCs適合在其內(nèi)三維培養(yǎng)。但