梓葛凍干粉針對(duì)腦缺血小鼠神經(jīng)功能和大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、背景:
　　 “梓葛凍干粉針劑”為課題組創(chuàng)制的抗腦缺血中風(fēng)的中藥新藥注射劑。其處方與制備方法已經(jīng)申請(qǐng)國家技術(shù)發(fā)明專利,該制劑主要藥效學(xué)研究已獲得重慶市科技攻關(guān)項(xiàng)目資助(CSTC,2010AC5011,徐曉玉主持)。前期已將葛根素、梓醇對(duì)腦缺血模型動(dòng)物的改善作用進(jìn)行了研究,該制劑對(duì)CoCl2所致的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用進(jìn)行了研究。本文觀察了該制劑對(duì)腦缺血?jiǎng)游锏纳窠?jīng)功能保護(hù)作用,能否促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)干細(xì)胞增殖和血管新生的作用,旨

2、在為原始創(chuàng)新藥物提供主要藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的:
　　 探討梓葛凍干粉針的兩種主要原料葛根素與梓醇單用及配伍對(duì)局灶性腦缺血模型小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用,以及梓葛凍干粉針對(duì)永久性腦缺血模型成年大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響。
　　 方法:
　　 1.梓醇、葛根素及其配伍對(duì)小鼠腦缺血損傷的保護(hù)
　　 (1)藥物對(duì)腦缺血小鼠氧化損傷的保護(hù)
　　 小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組,模型組,依達(dá)拉奉組,葛根素高、中、

3、低劑量組,梓醇高、中、低劑量組,和梓醇葛根素配伍高、中、低劑量組,于術(shù)前7d開始尾靜脈注射給藥,第7d線栓法制備小鼠永久局灶性大腦中動(dòng)脈栓塞模型(PMCAO),造模后3h再次給藥,給藥1h后斷頭取腦,測(cè)定大腦中丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活力。
　　 (2)藥物對(duì)腦缺血小鼠神經(jīng)功能及梗死體積的影響
　　 線栓法制備PMCAO模型,根據(jù)Longa評(píng)分結(jié)果,選取1～3分者,小鼠隨機(jī)分為

4、假手術(shù)組、模型組、梓醇中劑量、葛根素中劑量、梓醇葛根素配伍中劑量和依達(dá)拉奉4.5mg·kg-1組,各組給藥之前無顯著性差異(P＞0.05)。于術(shù)后3h開始給藥,此后每天尾靜脈注射給藥1次,連續(xù)7d,于缺血1、4和7d對(duì)小鼠神經(jīng)行為學(xué),神經(jīng)綜合功能進(jìn)行評(píng)分,于缺血第8d處死測(cè)定腦梗死體積。
　　 2.梓葛凍干粉針對(duì)腦缺血大鼠在體神經(jīng)干細(xì)胞增殖及血管新生的影響
　　 采用線栓法制備永久局灶性大腦中動(dòng)脈栓塞模型(PMCAO),

5、按照Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),將造模成功(1～2分者)的SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組,模型組,梓葛凍干粉針65.4mg·kg-1、32.7mg·kg-1和16.4mg·kg-1組,各組給藥之前無顯著性差異(P＞0.05),于模型成功后3h行尾靜脈注射給藥,以后每天給藥一次。在腦缺血后1、4和7d后的3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物,取大腦組織,免疫組織化學(xué)法檢測(cè)巢蛋白(Nestin)、5-溴脫氧尿嘧啶(BrdU)、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子1(CD31)和血管

6、內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.梓醇、葛根素及其配伍對(duì)小鼠腦缺血損傷的保護(hù)
　　 (1)藥物對(duì)腦缺血小鼠抗氧化損傷的保護(hù)
　　 與假手術(shù)組相比,模型組腦勻漿中MDA和NO含量顯著升高(P＜0.01),SOD活性顯著降低(P＜0.01),顯示造模成功。與模型組相比,葛根素高劑量,梓醇高劑量,梓醇葛根素配伍高劑量、中劑量和低劑量組MDA含量極顯著降低(P＜0.01),葛根素中劑量

7、、低劑量組,梓醇中劑量組MDA含量顯著降低(P＜0.05);配伍高劑量和中劑量組NO含量極顯著降低(P＜0.01),葛根素高劑量和中劑量組,梓醇中劑量組NO含量顯著降低(P＜0.05);葛根素高、中、低劑量組,梓醇高劑量,配伍高、中、低劑量組SOD活性極顯著升高(P＜0.01),梓醇中、低劑量組SOD活性顯著升高(P＜0.05)。
　　 (2)藥物對(duì)腦缺血小鼠神經(jīng)功能及梗死體積的影響
　　 與假手術(shù)組相比,模型組和各給藥

8、組1、4和7d神經(jīng)行為學(xué)和神經(jīng)綜合功能數(shù)值極顯著升高(P＜0.01),顯示造模成功。與模型組相比,缺血4d和7d,葛根素中劑量組、梓醇中劑量組神經(jīng)行為學(xué)分值顯著降低(P＜0.05);配伍中劑量組神經(jīng)行為學(xué)分值極顯著降低(P＜0.01);缺血4d,葛根素中劑量組、梓醇中劑量組、配伍中劑量組神經(jīng)綜合功能分值顯著降低(P＜0.05);缺血7d,葛根素中劑量組、梓醇中劑量、神經(jīng)綜合功能分值顯著降低(P＜0.05),配伍中劑量組神經(jīng)綜合功能分值極

9、顯著降低(P＜0.01);梓醇中劑量、葛根素中劑量組梗死體積顯著減小(P＜0.05),配伍中劑量組梗死體積極顯著降低(P＜0.01)。
　　 2.梓葛凍干粉針對(duì)腦缺血大鼠在體神經(jīng)干細(xì)胞增殖及血管新生的影響
　　 (1)梓葛凍干粉針對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響
　　 造模3h后Longa評(píng)分在1～2分的SD大鼠174只,其中假手術(shù)組(18只),各給藥組39只,各劑量1、4和7d三個(gè)亞組各13只。與假手術(shù)組相比,

10、模型組神經(jīng)行為學(xué),腦梗死體積顯著升高(P＜0.01),顯示造模成功,大鼠缺血側(cè)海馬DG區(qū)、SVZ和皮質(zhì)區(qū)BrdU和Nestin陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加(P＜0.01)。腦缺血損傷1、4和7d時(shí),BrdU和Nestin在缺血側(cè)不同腦區(qū)均有不等程度的表達(dá)。與模型組相比,梓葛凍干粉針65.4mg·kg-1能顯著提高缺血7d時(shí)DG區(qū)的細(xì)胞增殖(P＜0.01),梓葛凍干粉針65.4mg·kg-1和32.7mg·kg-1組能顯著提高缺血4d和7d時(shí)SVZ

11、和皮質(zhì)區(qū)的細(xì)胞增殖(P＜0.01);梓葛凍干粉針65.4mg·kg-1和32.7mg·kg-1組能顯著提高缺血4d和7d時(shí)Nestin在DG和皮質(zhì)區(qū)的表達(dá)(P＜0.01),顯著提高7d時(shí)SVZ的表達(dá)(P＜0.01)。
　　 (2)梓葛凍干粉針對(duì)腦缺血大鼠微血管密度和VEGF表達(dá)的影響
　　 造模3hLonga評(píng)分在1～2分的SD大鼠174只,其中假手術(shù)組(18只),各給藥組39只,各劑量1、4和7d亞組13只。與假手術(shù)組

12、相比,模型組神經(jīng)行為學(xué),腦梗死體積顯著升高(P＜0.01),顯示造模成功,缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)MVD數(shù)量明顯增加(P＜0.01),缺血側(cè)海馬DG區(qū)、SVZ和皮質(zhì)區(qū)VEGF陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P＜0.01)。缺血4d和7d,與模型組相比,梓葛凍干粉針65.4mg·kg-1和32.7mg·kg-1組能顯著增加海馬DG區(qū)、SVZ和皮質(zhì)區(qū)MVD的數(shù)量(P＜0.01);缺血1、4和7d時(shí),梓葛凍干粉針65.4mg·kg-1能顯著提高VEGF在海馬DG區(qū)、