OK-432腫瘤疫苗對(duì)DBA-2小鼠中脾臟淋巴細(xì)胞的抗腫瘤影響.pdf

1、目的：利用DBA/2小鼠移植舌癌荷瘤模型，探討OK-432腫瘤疫苗對(duì)DBA/2荷瘤小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中的Th1細(xì)胞因子以及對(duì)TNF-α分泌的影響。解明OK-432腫瘤疫苗的抗腫瘤免疫賦活作用及其調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步證實(shí)其在機(jī)體使用中的安全性和有效性。為體表粘膜腫瘤——口腔癌免疫輔助治療的臨床應(yīng)用和開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：選擇健康的六周齡DBA/2雌鼠作為受體進(jìn)行舌癌模型的建立。首先，培養(yǎng)KLN-205腫瘤細(xì)胞：將KLN-205腫瘤

2、細(xì)胞在37℃，5％CO2恒溫箱傳代培養(yǎng)，每次使用的培養(yǎng)液按照45ml的RPMI-1640培養(yǎng)液加入5ml胎牛血清，0.5ml的雙抗的比例配制。精制OK-432瘤苗：以glutaraldehyde(GA)為架橋劑，使得KLN-205細(xì)胞可以與OK-432產(chǎn)生交聯(lián)，構(gòu)建OK-432腫瘤疫苗。利用相位差熒光顯微鏡與電子顯微鏡確認(rèn)OK-432與KLN-205細(xì)胞交聯(lián)形態(tài)，以判斷疫苗是否制作成功。將四十八只健康的六周齡DBA/2雌性小鼠隨機(jī)的分為

3、OK-432組，PBS對(duì)照組，OK-432腫瘤疫苗組，每組16只。分別于小鼠右側(cè)腹腔注射以下試劑：OK-432組注射0.7KE/100μl；PBS對(duì)照組注射PBS液100μl；OK-432腫瘤疫苗組注射OK-432疫苗5×105/100μl，每周一次，連續(xù)注射三周。注射試劑結(jié)束后于第一天，第三天，第五天，第七天按組別取出脾臟，制取出脾臟淋巴細(xì)胞。用RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×106/ml,臺(tái)盼蘭染色檢

4、測(cè)脾細(xì)胞存活率大于95%；接種至培養(yǎng)板中，CO2恒溫培養(yǎng)箱中培育72小時(shí)。用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)培育72小時(shí)的脾臟細(xì)胞，調(diào)整其濃度為2×106/2ml。同時(shí)加入培養(yǎng)四代以上的KLN-205腫瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞。效靶比例為50：1、100：1。在CO2恒溫箱中共同培育24小時(shí)。將培育好的細(xì)胞混合液制取出上清液。ELISA定量檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的IFN-γ，IL-2，TNF-α等細(xì)胞因子的分泌水平。
　　結(jié)果：在腫瘤細(xì)胞的刺激下，體外培養(yǎng)72

5、小時(shí)后的脾淋巴細(xì)胞OK-432組及OK-432疫苗組均可以誘導(dǎo)產(chǎn)生出細(xì)胞因子IFN-γ，IL-2，TNF-α。OK-432腫瘤疫苗組中IFN-γ、IL-2以及TNF-α的含量明顯高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(P<0.05)。在疫苗組中IFN-γ與TNF-α的含量要高于IL-2在培養(yǎng)液中的濃度，其中TNF-α的濃度最高。IFN-γ在三組中總體呈上升趨勢(shì)，且在不同的實(shí)驗(yàn)組中含量明顯不同，OK-432組中明顯增高，要顯著高于對(duì)照組。在不同時(shí)期脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)

6、液中，細(xì)胞因子IL-2以及INF-γ的濃度也是有所變化的，尤其以IL-2為例，第一天略高，第七天呈下降趨勢(shì)。另外TNF-α的變化較為有特點(diǎn)，在第一天后顯著提升，在第三天到第五天階段較為平穩(wěn)，在第七天時(shí)出現(xiàn)回落。當(dāng)我們將靶細(xì)胞濃度提升一倍時(shí)，效應(yīng)細(xì)胞的免疫作用也相應(yīng)的提高，經(jīng)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子的濃度也相應(yīng)提升。以上所得數(shù)據(jù)P<0.05均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：OK-432腫瘤疫苗可刺激DBA/2小鼠脾臟細(xì)胞Th1細(xì)胞及TNF-α