HIFU治療后活化的淋巴細(xì)胞在腫瘤局部的特異性表達(dá)及其抗腫瘤效應(yīng).pdf

1、目的：
　　 在前期研究基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步觀察高強(qiáng)度聚焦超聲（highintensity focused ultrasound，HIFU）治療H22移植性肝癌荷瘤鼠后，外周血抗腫瘤細(xì)胞免疫功能的變化，過繼免疫后荷瘤鼠外周血淋巴細(xì)胞在腫瘤局部的特異性表達(dá)和抗腫瘤免疫功能的變化，為闡明}tlFU治療腫瘤所誘發(fā)的抗腫瘤免疫效應(yīng)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、HIFU治療后荷瘤鼠抗腫瘤細(xì)胞免疫功能的變化<

2、br>　　 72只成年健康C57BL/6J系小鼠，隨機(jī)分為三組：HIFU治療組（n=24）、HIFU假照組（n=24）和對照組（n=24）。前兩組小鼠背部皮下接種H22肝癌細(xì)胞株，成瘤后（接種7天時）分別接受HIFU治療或HIFU假照；對照組為正常小鼠，不接種腫瘤也不接受HIFU照射。三組小鼠在HIFU治療后第14天采取外周血，淋巴細(xì)胞密度梯度離心法分離外周血淋巴細(xì)胞，MHC-肽五聚體特異性熒光染色，流式細(xì)胞術(shù)分析CTL細(xì)胞數(shù)量的變化

3、；乳酸脫氫酶釋放法檢測淋巴細(xì)胞對同種腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷活性；酶聯(lián)免疫吸附法檢測淋巴細(xì)胞與H22細(xì)胞共培養(yǎng)24小時后上清液IFN-γ、TNF-α的含量。
　　 2、過繼免疫HIFU活化的CTL在荷瘤鼠腫瘤局部的特異性表達(dá)
　　 24只背部皮下接種H22肝癌細(xì)胞株成功的C57BL/6J小鼠，在接種7天時隨機(jī)分為三組：HIFU治療組（n=8）、HIFU假照組（n=8）和對照組（n=8）。三組小鼠分別接受尾靜脈注射HIFU治療

4、、HIFU假照后荷瘤鼠和正常小鼠經(jīng)MHC-肽五聚體熒光染色的外周血淋巴細(xì)胞1×107個/只。輸注24小時后處死小鼠，手術(shù)取出各組小鼠接種部位腫瘤組織塊作冰凍切片，激光共聚焦顯微鏡觀察熒光染色陽性的CTLs在腫瘤局部的表達(dá)，圖像分析軟件分析CTLs的數(shù)量，HE染色，光鏡下觀察、比較CTLs的分布情況。
　　 3、過繼免疫HIFU活化的CTL在荷瘤鼠腫瘤局部的功能變化
　　 30只背部皮下接種H22肝癌細(xì)胞株成功的C57BL

5、/6J小鼠，在接種-7天時隨機(jī)分為三組：HIFU治療組（n=10）、HIFU假照組（n=10）和對照組（n=10）。三組小鼠分別接受尾靜脈注射HIFU治療、HIFU假照荷瘤鼠和正常小鼠外周血淋巴細(xì)胞1×107個/只。輸注7天后處死小鼠，手術(shù)取出各組小鼠接種部位腫瘤組織塊，制備成單細(xì)胞懸液，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法檢測腫瘤局部淋巴細(xì)胞功能的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、HIFU治療后荷瘤鼠抗腫瘤細(xì)胞免疫功能的變化
　　 H

6、IFU治療后第14天，HIFU組、假照組和對照組淋巴細(xì)胞中CTL細(xì)胞表達(dá)率（％）分別為1.9±3：0.08、1.42±0.09和對照組1.27±0.05，與假照組或?qū)φ战M比較，HIFU組CTL細(xì)胞明顯增加，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　 HIFU組、假照組、對照組小鼠外周血淋巴細(xì)胞對H22腫瘤細(xì)胞的殺傷率隨效靶比的增加而升高，HIFU組在1：1、2.5：1、5：1、10：1效靶比時的淋巴細(xì)胞殺傷率（％）分別為3.

7、01±1.02、13.76±2.21、33.38±3.68、51.59±3.74；與假照組或?qū)φ战M比較，效靶比在2.5：1、5：1、10：1時HIFU組淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒活性明顯增加，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　 HIFU組、假照組、對照組小鼠外周血淋巴細(xì)胞與H22腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)24h時上清液INF-γ和TNF-α濃度隨效靶比的增加而升高，HIFU組在1：1、10：1、20：1、40：1效靶比時，上清液INF-γ

8、含量（pg/ml）分別為141.17±19.24、178.46±16.56、443.98±13.26、743.43±18.18；TNF-α含量（pg/ml）分別為242.41±21.74、510.07±16.63、764.86±15.86、1212.83±89.21；與假照組或?qū)φ战M比較，效靶比在1：10、1：20、1：40時HIFU組上清液TNF-α和INF-γ含量明顯增加，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　 2、

9、過繼免疫HIFU活化的CTL在荷瘤鼠腫瘤局部的特異性表達(dá)
　　 MHC-肽五聚體熒光染色的淋巴細(xì)胞過繼免疫治療后1天，HIFU組7只小鼠，假照組6只小鼠，對照組2只小鼠腫瘤局部有呈PE標(biāo)記的MHC-肽五聚體紅色熒光、FITC標(biāo)記的CD8分子綠色熒光的陽性細(xì)胞和MHC-肽五聚體和CD8雙重染色陽性的呈黃色熒光的淋巴細(xì)胞出現(xiàn)；CTL細(xì)胞主要分布在腫瘤與正常組織交界區(qū)，腫瘤中央?yún)^(qū)未見表達(dá)；HIFU組CTL細(xì)胞數(shù)每個視野17.13±8.

10、29個，假照組10.37±6.47個，對照組0.83±0.74個，與假照組及對照組比較，HIFU組CTL細(xì)胞數(shù)量明顯增多，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 3、過繼免疫HIFU活化的CTL在荷瘤鼠腫瘤局部的功能變化
　　 淋巴細(xì)胞過繼免疫治療后7天，HIFU組、假照組和對照組能分泌INF-γ的淋巴細(xì)胞數(shù)（個/孔）分別為110±18.04、38±9.41和23±1.87，與假照組或?qū)φ战M比較，HIFU組能分泌

11、INF-γ淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增加，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　 結(jié)論:
　　 1、HIFU治療H22移植性肝癌后，荷瘤鼠外周血淋巴細(xì)胞受到活化，CTL細(xì)胞數(shù)量明顯增多，對同種腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷活性明顯增強(qiáng)。
　　 2、HIFU活化的淋巴細(xì)胞過繼免疫治療同種腫瘤荷瘤鼠后，CTL細(xì)胞在腫瘤局部的特異性表達(dá)明顯增加，表明活化的CTL細(xì)胞能從外周血遷移到腫瘤局部。
　　 3、HIFU活化的淋巴細(xì)