雷帕霉素對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟的保護作用及機制研究.pdf

1、腎間質(zhì)纖維化是各種原因所致腎臟疾病進展至終末期的共同途徑和主要病理特征，其病理改變表現(xiàn)為腎小管萎縮，間質(zhì)成纖維細胞增生及細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度積聚。大量動物實驗和臨床試驗表明，腎小管間質(zhì)病變程度預示著腎功能受損的程度，決定慢性腎臟病患者的預后。間質(zhì)纖維化的發(fā)生進展機制錯綜復雜，目前尚無有效的方法阻斷腎纖維化的進展。
　　雷帕霉素是一種從放線菌培養(yǎng)液中提取出來的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，其在體內(nèi)的

2、直接作用靶點是mTOR(mammalian target of rapamycin)。mTOR是控制細胞生長和增殖所必需的絲/蘇氨酸激酶，雷帕霉素通過與mTOR結合后，激活細胞生長抑制和存活反應，因其對細胞具有非選擇性抑制增殖作用，其研究及應用廣泛，目前在臨床上主要作為免疫抑制劑，主要用于器官移植抗排異反應。有文獻報道，RAP可抑制腎小管上皮細胞的增殖，包括抑制PKD大鼠模型囊性和非囊性小管的增殖，并可減輕腎間質(zhì)纖維化，但其作用機制卻未

3、完全明確。本研究通過對大鼠進行單側(cè)輸尿管結扎(unilateral ureteric obstruction，UUO)建立腎間質(zhì)纖維化模型，動態(tài)觀察雷帕霉素對梗阻側(cè)腎臟的病理改變及生化指標的影響，觀察雷帕霉素對腎臟纖維化進程中AQP2與EnaC，Bcl-2與Bax、casepase-3等相關調(diào)控因子的影響，tune1染色觀察其對凋亡的影響，深入探討其對腎間質(zhì)纖維化的影響及可能機制，為臨床防治腎間質(zhì)纖維化尋找新的途徑。
　　第一部分

4、：雷帕霉素對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎功能及殘余腎組織形態(tài)學的影響
　　目的:觀察雷帕霉素對單側(cè)輸尿管結扎大鼠腎臟病變的影響
　　材料與方法：
　　1.動物模型制備與分組給藥
　　72只雄性wistar大鼠（購于溫州醫(yī)學院動物實驗中心）隨機分為3組:假手術組，單側(cè)輸尿管結扎組(UUO)，雷帕霉素干預組(Rap)。假手術組開腹后游離左側(cè)輸尿管隨即縫合皮膚，UUO組和雷帕霉素治療組進行左側(cè)輸尿管雙結扎，治療組在UUO的基礎

5、上每天以雷帕霉素2mg/Kg.d(0.4ml/d)灌胃;假手術組和模型組給予等量的生理鹽水灌胃。
　　三組大鼠分別于術后第4天，7天、14天處死前留取24小時尿，進行24h尿蛋白及尿鈉檢測;于處死時末股動脈取血，檢測血清BUN、Cr，取部分腎組織行HE、Masson染色光鏡下觀察腎臟病理改變，并采用百分比評分法進行腎臟間質(zhì)纖維化指數(shù)的半定量分析。
　　結果:
　　三組于第4，7，14天尿鈉水平比較未見明顯差異(P＞0.

6、05)，第14天數(shù)值Rap組高于UUO組，與假手術組比略低，三組比較未見統(tǒng)計學意義;術后第4、7、14天，假手術組，與UUO組及Rap治療組的24h尿蛋白定量三組無顯著性差異(P＞0.05);各組大鼠的血肌酐，血尿素氮在各時間點比較未見明顯差異(P＞0.05);HE與Masson染色示:假手術組在各時間點腎臟未見病理病變。UUO組術后第4天出現(xiàn)腎間質(zhì)炎性細胞浸潤及輕微腎間質(zhì)纖維化，并隨梗阻時間的延長而加重，Rap與UUO組在各時間點相比

7、較，腎間質(zhì)炎癥細胞浸潤和纖維化相對減輕;腎間質(zhì)纖維化的半定量分析示UUO組與假手術組比較，腎間質(zhì)纖維化明顯(P＜0.05);Rap組腎間質(zhì)纖維化明顯輕于UUO組(P＜0.05)。
　　結論:
　　雷帕霉素可減輕腎間質(zhì)纖維化的程度，對梗阻腎臟具保護作用。
　　第二部分：雷帕霉素對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織AQP2及ENaC表達的影響
　　目的:
　　通過測定梗阻側(cè)腎臟AQP2及ENaC的表達探討雷帕霉素對梗阻腎

8、功能保護作用。
　　方法:
　　動物模型制備與分組給藥同第一部分;用免疫組化法觀察腎組織AQP2及ENaC的表達，Westem雜交分析法檢測AQP2及ENaC蛋白表達情況。
　　結果:
　　各組大鼠腎組織AQP2及ENaC蛋白的免疫組織化學分析:EnaC在假手術組中各時間點均可于腎臟近髓質(zhì)連接管和集合管上皮細胞見大量棕黃色顆粒，AQP2于腎臟髓質(zhì)深部集合管部上皮細胞胞漿及胞膜處大量表達，二者在腎間質(zhì)及腎小球未見表

9、達;UUO組、Rap組較假手術組表達陽性細胞減少，表達強度減弱(P＜0.01);與雷帕霉素組比較，UUO組減少更為明顯(P＜0.05)。
　　AQP2及ENaC蛋白表達的Western Blot定量分析結果與免疫組化結果一致
　　結論:
　　在單側(cè)輸尿管梗阻腎間質(zhì)纖維化模型中，雷帕霉素減少了AQP2及ENaC蛋白的丟失。
　　第三部分：雷帕霉素對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織Bcl-2與Bax及casepase-3表達

10、的影響
　　目的:
　　通過測定梗阻側(cè)腎臟tunel結果及Bcl-2與Bax及easepase-3蛋白的表達對雷帕霉素減輕腎間質(zhì)纖維化和腎功能保護的機理進行初步探討
　　方法:
　　1.動物模型制備與分組給藥同第一部分。
　　2.大鼠殘余腎冰凍切片Tunel法染色觀測細胞凋亡活性
　　3.免疫組織化學法與Western Blot檢測Bcl-2與Bax及casepase-3蛋白表達的方法
　　結果

11、:
　　1.組織凋亡活性
　　假手術組各時間點僅見有少量凋亡細胞;UUO組、Rap組可見大量凋亡細胞細胞，于第7天最多，第14天減少，二者明顯高于假手術組比，P＜0.05;與UUO組比較，Rap組明顯減少，P＜0.05。
　　2.各組大鼠腎組織Bcl-2與Bax及casepase-3蛋白的免疫組織化學檢測
　　假手術組Bcl-2與Bax及casepase-3蛋白于腎小管，腎間質(zhì)及腎小球僅有極少量表達，各時間點一致

12、，P＞0.05;在UUO組Bcl-2蛋白于術后第4天可見明顯表達，主要分布腎小管胞質(zhì)，腎間質(zhì)及腎小球僅見少量表達，第7天達高峰，第14天明顯下降;Rap組表達的時間與區(qū)域與UUO組一致，其染色強度及區(qū)域高于UUO組，P＜0.05;
　　Bax及casepase-3蛋白在UUO組、Rap組于術后第4天可見主要在腎小管尤其遠端肥大或管腔增大的腎小管上皮細胞（Bax主要在胞質(zhì)，casepase-3主要在胞核）表達，腎間質(zhì)及腎小球皆亦見明

13、顯表達，于第7天達高峰，第14天下降，此時腎小球的表達量亦有所增加;但Rap組Bax及casepase-3蛋白染色強度及區(qū)域低于UUO組,P＜0.05。
　　3.Western Blot檢測Bcl-2與Bax及casepase-3蛋白的表達
　　各組大鼠蛋白在分子量為26kDa，22kDa及35kDa處依次可見Bcl-2、bax及Caspase-3條帶。Bcl-2與Bax及casepase-3蛋白假手術組蛋白條帶淡，幾乎未見

14、明顯表達，于各時間點一致，與其他兩組相比其IOD值最低(P＜0.05);對Bcl-2蛋白條帶行進行定量分析，在Rap組與UUO組，其蛋白表達量在時間變化上第7天最高，第14天最低，Rap組表達高于UUO組(P＜0.05); Bax、casepase-3蛋白Rap組及UUO組在各時間點上變化規(guī)律一致，于術后第7天達高峰，第14天下降，但表達量上仍高于第4天，UU0組Bax蛋白表達優(yōu)于Rap組(P＜0.05)。
　　結論: