MGMT基因表達(dá)在腎細(xì)胞癌治療中的作用研究.pdf

1、腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)在所有腎細(xì)胞癌占75％-80％，是最常見的病理類型。化療仍是目前臨床上常用的方法，但治療效果常因腫瘤本身具有耐藥或治療后出現(xiàn)耐藥性而失敗。目前為止，耐藥機(jī)制主要有P-糖蛋白的過表達(dá)、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的低表達(dá)、抗凋亡基因bcl-2的過表達(dá)以及DNA修復(fù)蛋白的過表達(dá)等。
　　烷化劑是一大類重要的臨床抗腫瘤藥物，主要造成DNA堿基的烷基化損傷，其中

2、以形成O6-甲基鳥嘌呤對(duì)細(xì)胞的威脅最大，造成細(xì)胞突變與死亡。O6-甲基鳥嘌呤可以由O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)修復(fù)。MGMT對(duì)烷化劑損傷的修復(fù)使其在腫瘤化療中發(fā)揮雙重作用。一方面保護(hù)正常組織免于烷化劑的損傷和二次癌癥的發(fā)生，另一方面引起腫瘤組織對(duì)烷化劑類化療藥物的耐藥性。
　　MGMT的表達(dá)在正常組織中要低于其腫瘤組織，而且不同腫瘤組織中呈現(xiàn)出不一樣的模式。然而，在腎透明細(xì)胞癌中MGMT基因的表達(dá)目前仍不清楚。甲

3、基化抑制劑5-Aza-CdR能夠逆轉(zhuǎn)DNA的異常甲基化、重新激活失活的抑癌基因的表達(dá)，因此其具有作為抗腫瘤藥物的潛力。
　　本課題擬從基因和蛋白水平研究MGMT基因在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)，并闡明MGMT在耐藥腎透明細(xì)胞癌治療中的作用。同時(shí)我們將5-Aza-CdR與絲裂霉素聯(lián)合作用于腎癌細(xì)胞，探討應(yīng)用5-Aza-CdR能否提高腎癌細(xì)胞對(duì)絲裂霉素的敏感性。
　　第一部分 MGMT基因表達(dá)對(duì)腎細(xì)胞癌的耐藥性影響的研究
　　一

4、、MGMT在腎透明細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)
　　1、采用免疫組化的方法對(duì)60個(gè)組織標(biāo)本中的MGMT表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。免疫組化染色著色結(jié)果可以將60例病例分為MGMT不表達(dá)(-)，低表達(dá)(+)和高表達(dá)(++，+++)三組，其中高表達(dá)的組占62％(37/60)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，與正常組織相比，腫瘤組織中MGMT mRNA水平表達(dá)上調(diào)2倍以上的占85％(17/20)
　　2、選取兩株癌細(xì)胞ACHN和786-0以及正常腎

5、細(xì)胞株HK-2為研究對(duì)象。結(jié)果表明兩株癌細(xì)胞中MGMT mRNA水平遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞。Western blot結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了MGMT在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。
　　二、MGMT表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌的階段有關(guān)
　　進(jìn)一步分析了MGMT水平與癌癥進(jìn)程之間的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)MGMT表達(dá)水平與腫瘤病理級(jí)別和臨床階段有著正相關(guān)。在G1，G2和G3/G4期的腎透明細(xì)胞癌中MGMT高表達(dá)的比例分別占40.0％，67.7％和77.3％(p=0.04)

6、。在T1，T2和T3/T4階段中MGMT高表達(dá)比例分別為39.1％，70.1％和80.0％(p=0.02)。
　　三、下調(diào)MGMT表達(dá)可以增強(qiáng)ACHN和786-0細(xì)胞對(duì)烷化劑BCNU或TMZ的敏感性。
　　1、首先通過western blot檢測(cè)siRNA的作用，干擾siRNA作用48h后MGMT蛋白表達(dá)明顯下降。
　　2、MTT結(jié)果顯示，下調(diào)MGMT表達(dá)可以使ACHN細(xì)胞對(duì)烷化劑BCNU和TMZ更加敏感，
　　

7、3、以腫瘤細(xì)胞株786-0為對(duì)象進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。下調(diào)MGMT同樣顯著增加786-0細(xì)胞對(duì)烷化劑BCNU和TMZ的敏感性。
　　第二部分 5-Aza-CdR對(duì)腎癌細(xì)胞株CAKI-1及786-0的化療敏感性的影響一、 MTT法檢測(cè)絲裂霉素對(duì)CAKI-1細(xì)胞抑制作用
　　我們用MTT法分別檢測(cè)不同濃度絲裂霉素作用于CAKI-1細(xì)胞24 h的生長抑制率，發(fā)現(xiàn)絲裂霉素能抑制細(xì)胞的增值，并呈現(xiàn)劑量依賴性。
　　二、初步結(jié)果顯示甲基化抑制

8、劑5-Aza-CdR能夠增強(qiáng)腎癌細(xì)胞786-0對(duì)絲裂霉素的敏感性
　　MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)單用5-Aza-CdR對(duì)人腎癌細(xì)胞株786-0增值呈現(xiàn)明顯的抑制作用。不同濃度的5-Aza-CdR聯(lián)合絲裂霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，隨著5-Aza-CdR濃度的增加，腫瘤細(xì)胞的抑制率明顯升高。
　　第三部分 結(jié)論及創(chuàng)新點(diǎn)
　　一、結(jié)論
　　1、研究證實(shí)了MGMT在腎透明細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)呈高表達(dá);
　　2

9、、研究分析發(fā)現(xiàn)MGMT的表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌的惡性程度呈正相關(guān);
　　3、MGMT參與腎透明細(xì)胞癌對(duì)烷化劑類化療藥物的耐藥過程;
　　4、甲基化抑制劑5-Aza-CdR能夠增強(qiáng)腎癌細(xì)胞786-0對(duì)絲裂霉素的敏感性。
　　二、創(chuàng)新點(diǎn)與不足之處
　　1、本研究首次證實(shí)了MGMT在腎透明細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中表達(dá)高表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)MGMT的表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌的惡性程度呈正相關(guān)。本研究首次發(fā)現(xiàn)下調(diào)MGMT表達(dá)可以增強(qiáng)AC