超聲微泡載EGFP質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染新生血管性角膜組織的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、角膜是眼球重要的屈光介質(zhì)之一，無血管組織是其主要特點(diǎn)，在各種病理?xiàng)l件下新生血管長入透明角膜中，導(dǎo)致角膜新生血管（Corneal neovascular，CNV）生成。其所致的角膜新生血管性疾病是目前致盲的主要原因之一，因此抑制角膜新生血管形成是挽救角膜盲患者視力，提高患者生活質(zhì)量的重要途徑之一。近年來，抑制角膜新生血管的研究熱點(diǎn)是基因治療，但現(xiàn)有基因轉(zhuǎn)染方法及基因載體不能令人滿意。因此，尋找安全、高效、可控和簡便實(shí)用的基因載體及基因轉(zhuǎn)染

2、方法已成為基因治療研究的重點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，超聲醫(yī)學(xué)在長期發(fā)展中，從診斷超聲、治療超聲走向兩個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域：藥物輸送和基因治療。超聲靶向破壞微泡（Ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）所產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)能夠增加細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)外源物質(zhì)進(jìn)入靶細(xì)胞。本課題第一部分探索性的利用超聲聯(lián)合微泡作用于活體正常角膜組織，研究其對(duì)正常角膜組織的生物學(xué)效應(yīng)；第二部分在成功制備兔角膜新生血

3、管模型的基礎(chǔ)上，采用超聲微泡作為載體，運(yùn)載基因至活體角膜組織，檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染效率，探討了超聲微泡作為靶向載體轉(zhuǎn)染外源基因的可行性和效率，為新生血管性角膜疾病的治療提供了一種新思路和新手段。 第一部分超聲微泡對(duì)正常角膜組織的生物效應(yīng) 目的:觀察不同聲強(qiáng)和輻照時(shí)間的超聲破壞微泡對(duì)兔正常角膜組織的生物學(xué)效應(yīng)。 方法:采用不同聲強(qiáng)（0.5 W/c㎡，1.0 W/c㎡，2.0W/c㎡）和輻照時(shí)間（30 s，60 s，120

4、s）的超聲作用于微泡干預(yù)的兔眼角膜，并對(duì)角膜進(jìn)行定量分析和組織學(xué)觀察。 結(jié)果:超聲聲強(qiáng)1.0、2.0W/c㎡與0.5 W/c㎡組比較，角膜組織損害嚴(yán)重，內(nèi)皮細(xì)胞密度（endothelial cell density，ECD），六角形細(xì)胞比例（percentage of hexagonal，6A）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；超聲輻照時(shí)間120 s與30 s、60 s比較，內(nèi)皮細(xì)胞密度（ECD），六角形細(xì)胞比例（6A）差異有統(tǒng)

5、計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。 結(jié)論:超聲聯(lián)合微泡能明顯增強(qiáng)角膜組織的空化效應(yīng)，且超聲能量越大，角膜組織損害越嚴(yán)重。 第二部分載EGFP質(zhì)粒DNA超聲微泡轉(zhuǎn)染新生血管性角膜組織的研究 目的:探討超聲微泡載EGFP質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染新生血管性角膜組織的可行性及效率。 方法:采用縫線法誘導(dǎo)角膜新生血管模型成功后，利用隨機(jī)分組法將其分為四組：A組裸質(zhì)粒組；B組質(zhì)粒加超聲輻照組；C組質(zhì)粒-微泡復(fù)合物組；D組質(zhì)粒-微泡復(fù)合

6、物加超聲輻照組。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后HE染色觀察角膜組織病理變化，并采用激光共聚焦顯微鏡觀察質(zhì)粒DNA熒光蛋白表達(dá)強(qiáng)度。 結(jié)果:D組（133.03±21.99）熒光蛋白表達(dá)強(qiáng)度明顯高于A組、B組和C組（A組：75.17±7.08；B組：97.02±8.31；C組：81.83±9.44），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.56，P<0.05）。 結(jié)論:在一定聲強(qiáng)和輻照時(shí)間的超聲作用下，超聲微泡能有效提高質(zhì)粒DNA在新生血管性角膜組織的基因