穩(wěn)定共表達(dá)A2單倍型鴨TAP1和TAP2蛋白細(xì)胞系的建立.pdf

1、抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體(Transporter associated with antigen processing，TAP)屬ABC(ATP-bindingcassette，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)器家族，其編碼基因TAP1和TAP2均位于主要組織相容性復(fù)合體(Majorhistocompatibility complex，MHC)。TAP1和TAP2編碼的蛋白組成二聚體。在不同種屬動(dòng)物體內(nèi)，TAP1和TAP2在MHC上的具體位置不同。TAP在多種伴

2、侶分子的協(xié)同下，包括鈣網(wǎng)蛋白、鈣聯(lián)蛋白、氧化還原酶ERp57和TAP相關(guān)蛋白(tapasin)等，將胞漿內(nèi)被蛋白酶體降解的內(nèi)源性抗原肽轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與MHCⅠ類分子結(jié)合，所形成的MHC-肽復(fù)合物通過高爾基體被提呈到細(xì)胞表面，引起細(xì)胞毒性T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。TAP蛋白的缺失和突變會(huì)影響抗原肽的提呈，最終損害免疫應(yīng)答功能。
　　本研究采用RT-PCR技術(shù)從HBK-SPF鴨脾臟中擴(kuò)增得到TAP1和TAP2基因，序列分析表明TAP2基因的多

3、態(tài)性高于TAP1。利用單核苷酸多態(tài)性(SNP)分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)正在選育的第3代單倍型鴨的TAP2基因型進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明單倍型鴨的MHC型保持穩(wěn)定。經(jīng)過序列比對(duì)，A2品系的SNP最多，進(jìn)一步對(duì)A2品系的TAP1和TAP2基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。
　　將A2單倍型鴨的TAP1（A2TAP1）全部編碼區(qū)和A2 TAP2的肽結(jié)合區(qū)分別克隆至pET-30a(+)，成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-A2TAP1和pET-A2TAP2

4、PBD，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得以包涵體形式存在的特異性條帶，大小分別約為51kDa和22kDa重組蛋白。重組蛋白免疫BALB/c小鼠，制備并純化了鼠多抗血清。
　　將編碼A2TAP1和A2TAP2的全基因同時(shí)克隆到真核表達(dá)載體pIRES中，獲得真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-A2TAP1-A2TAP2。利用Amaxa Cell Line Nucleofector KitL將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染至小鼠淋巴細(xì)胞系R