miR-146b-5p異常減少在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、[目的]miR-146b-5p是膠質(zhì)瘤的抑癌miRNA(TumoursuppressingmiRNA，TS-miRNA)。浸潤性生長是膠質(zhì)瘤的突出特征，也是導(dǎo)致其手術(shù)不易全切、術(shù)后復(fù)發(fā)率高及預(yù)后不良的主要原因。已知基質(zhì)金屬蛋白酶16(Martrixmetalloproteinase16，MMP16)過表達(dá)與多種顱外惡性腫瘤的浸潤性生長密切相關(guān)。生物信息學(xué)預(yù)測提示MMP16可能是miR-146b-5p的天然靶基因。然而，不同級別膠質(zhì)瘤細(xì)胞

2、中miR-146b-5p及MMP16的表達(dá)有無差異，二者表達(dá)變化的相互關(guān)系及其在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中有何作用，miR-146b-5p對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、遷移和凋亡有何影響及其分子機(jī)制，均尚不清楚。本研究旨在對上述問題進(jìn)行深入系統(tǒng)的探討。
　　 [研究方法](1)利用鎖定寡核苷酸探針原位雜交和免疫組織化學(xué)方法分別檢測了10例人非腫瘤對照腦組織和60例不同級別膠質(zhì)瘤組織中miR-146b-5p和MMP16的表達(dá)狀況。(2)采用熒光素酶實

3、驗、qRT-PCR及Westernblot驗證MMP16是否是miR-146b-5p的靶基因，進(jìn)一步研究miR-146b-5p下調(diào)MMP16表達(dá)的機(jī)制。(3)經(jīng)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和G418篩選建立穩(wěn)定過表達(dá)miR-146b-5p的人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(U87MG、SNB19、TJ905)的亞細(xì)胞系及它們的對照亞細(xì)胞系，采用stem-loopqRT-PCR、普通qRT-PCR和Westernblot分別檢測各亞細(xì)胞系miR-146b-5p、MM

4、P16mRNA和MMP16蛋白的表達(dá)水平。(4)采用Westernblot和明膠酶譜檢測驗證上調(diào)miR-146b-5p表達(dá)是否能抑制MMP16的表達(dá)和阻斷MMP2酶原激活。(5)利用體外侵襲遷移實驗和Matrigel3D培養(yǎng)來比較miR-146b-5p過表達(dá)亞細(xì)胞系和相應(yīng)對照亞細(xì)胞系的侵襲遷移能力;用靶向MMP16的特異性siRNA阻斷MMP16表達(dá)，進(jìn)一步驗證miR-146b-5p是否是通過下調(diào)MMP16表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲

5、。(6)通過流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和堿性單細(xì)胞電泳實驗(SCGE)來評價各亞細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡水平。(7)通過流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測各亞細(xì)胞系細(xì)胞周期分布情況。
　　 [研究結(jié)果](1)原位雜交結(jié)果顯示，WHOⅠ～Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級膠質(zhì)瘤組的miR-146b-5p陽性標(biāo)記指數(shù)(LI％)分別為13.34±0.14、8.60±0.17、2.90±1.26，并均明顯低于非腫瘤對照腦組織的LI％（34.23±1.58，P＜0.0001）;m

6、iR-146b-5p表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤良惡性級別的升高相應(yīng)降低，除Ⅰ～Ⅱ級組與Ⅲ級組外，其余各組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。而MMP16表達(dá)水平則呈相反趨勢，對照腦組織的MMP16LI％最低（0.40±0.55），且其表達(dá)水平隨膠質(zhì)瘤良惡性級別增加相應(yīng)升高(WHOⅠ～Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級組分別為25.99±1.24、30.99±1.30、64.37±6.26);除Ⅰ～Ⅱ組與Ⅲ組之間外，其余各組間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.

7、0001）。經(jīng)直線相關(guān)分析證實，以上兩種指標(biāo)之間呈顯著性負(fù)相關(guān)(r=-0.634,P＜0.0001)。(2)熒光素酶實驗結(jié)果顯示，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞里，miR-146b-5p可通過與野生型MMP16mRNA的3'UTR特異性結(jié)合，介導(dǎo)其對熒光素酶報導(dǎo)基因表達(dá)的沉默作用;因miR-146b-5p不能與突變型MMP16mRNA的3'UTR結(jié)合，當(dāng)用二者共轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞時不能沉默熒光素酶報導(dǎo)基因的表達(dá);從而證實MMP16是miR-146b-5p的天

8、然靶基因。(3)與相應(yīng)的對照亞細(xì)胞系相比，miR-146b-5p過表達(dá)亞細(xì)胞系的miR-146b-5p表達(dá)水平明顯升高，而MMP16mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯降低，說明miR-146b-5p可以通過直接降解MMP16mRNA阻斷MMP16表達(dá)。(4)miR-146b-5p不影響pro-MMP2的表達(dá)，而是通過抑制MMP16的表達(dá)阻斷細(xì)胞外pro-MMP2的激活過程。(5)過表達(dá)miR-146b-5p可通過上述機(jī)制有效的抑制膠質(zhì)瘤絀胞遷

9、移和侵襲，而MMP16特異性小干擾RNA可以部分的模擬miR-146b-5p對膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用，表明miR-146b-5p/MMP16/MMP2通路在miR-146b-5p介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲抑制效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。(6)流式細(xì)胞術(shù)及堿性單細(xì)胞電泳實驗結(jié)果顯示，miR-146b-5p過表達(dá)亞細(xì)胞系的凋亡指數(shù)(AI％)明顯高于對照亞細(xì)胞系，但是細(xì)胞周期分布無明顯改變，提示miR-146b-5p可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡而不抑

10、制其增殖。
　　 [結(jié)論]
　　 (1)隨著膠質(zhì)瘤惡性度的升高，miR-146b-5p表達(dá)水平降低，而MMP16表達(dá)水平增加，二者呈顯著負(fù)相關(guān)，miR-146b-5p和MMP16表達(dá)水平可作為評價膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為及患者預(yù)后的重要參考指標(biāo)。
　　 (2)本研究建立的miR-146b-5p過表達(dá)亞細(xì)胞系可穩(wěn)定高表達(dá)miR-146b-5p，是研究miR-146b-5p抑瘤效應(yīng)的理想細(xì)胞模型。
　　 (3)在膠質(zhì)

11、瘤細(xì)胞中，MMP16是miR-146b-5p的天然靶基因，miR-146b-5p通過直接降解其mRNA來下調(diào)MMP16蛋白表達(dá)。
　　 (4)miR-146b-5p不影響pro-MMP2的表達(dá)，而是通過抑制MMP16的表達(dá)阻斷細(xì)胞外pro-MMP2激活過程，進(jìn)而有效的抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲。
　　 (5)miR-146b-5p對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期分布無影響;但可顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和誘導(dǎo)其凋亡，但后兩種調(diào)控作用的