miR-29異常減少在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制研究.pdf

1、目的: 近來的研究表明，miR-29家族(miR-29a、miR-29b、miR-29c，miR-29s)是一種重要的抑瘤微小RNA（TS-miRNA），其表達異常減少與多種顱外惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。生物信息學預(yù)測顯示細胞分裂周期蛋白42(CDC42)及細胞周期依賴性激酶(CDK6)是miR-29家族的潛在靶基因，且兩者表達水平隨多種腫瘤惡性程度升高而相應(yīng)增加。但是，膠質(zhì)瘤細胞中miR-29s及其上述靶基因的表達有何改變，其與膠

2、質(zhì)瘤良惡性級別的關(guān)系及在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及如何，尚不清楚。膠質(zhì)瘤細胞中CDC42和CDK6是否是miR-29s的天然靶基因，miR-29s敲低上述靶基因表達的機制如何尚需進一步證實。此外，外源性miR-29s對膠質(zhì)瘤細胞遷移、侵襲、增殖、凋亡和細胞周期分布有何影響，miR-29s特異性敲低CDC42和CDK6表達是否是其發(fā)揮上述抑瘤作用的分子機制亦需觀察驗證。本研究以不同級別人膠質(zhì)瘤標本和人膠質(zhì)母細胞瘤細胞系為研究對象，對上述問題

3、進行研究。
　　 方法: ①采用鎖定寡核苷酸探針原位雜交及免疫組織化學方法，檢測60例不同級別膠質(zhì)瘤組織標本及10例對照腦組織中miR-29a/b/c及Ki-67抗原的表達水平。②采用熒光素酶實驗在膠質(zhì)瘤細胞系U87MG及U251中驗證CDC42是否是miR-29s的天然靶基因，通過檢測轉(zhuǎn)染miR-29a/b/c mimics后上述細胞系CDC42 mRNA及蛋白表達水平的變化，探索miR-29s敲低CDC42表達的分子機制。③

4、通過體外遷移、侵襲實驗觀察轉(zhuǎn)染miR-29a/b/c等量混合物（miR-29mix組）后U87MG及U251細胞侵襲遷移能力的改變;通過觀察外源性CDC42能否逆轉(zhuǎn)上述改變證實特異性敲低CDC42表達是否是miR-29s抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移、侵襲的分子機制。④觀察miR-29mix組Ki-67陽性標記指數(shù)的變化及補充外源性CDC42對該變化的影響，對比穩(wěn)定過表達miR-29a/b/c的各U251亞細胞系與scr過表達U251亞細胞系和U2

5、51細胞系克隆形成效率的差異，以明確miR-29對惡性膠質(zhì)瘤細胞增殖的抑制作用及其分子機制。⑤通過Caspase3/7活性檢測和流式凋亡檢測，觀察轉(zhuǎn)染miR-29mix后膠質(zhì)母細胞瘤細胞系凋亡水平的改變及共轉(zhuǎn)染CDC42對細胞凋亡的挽救效應(yīng);比較miR-29s/CDC42通路對U87MG細胞系（p53野生型）及U251細胞系(p53突變型)凋亡誘導作用的差異及其對野生和突變型p53表達水平影響的差異，明確該通路調(diào)控惡性膠質(zhì)瘤細胞凋亡的機

6、制及其與p53結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。⑥通過構(gòu)建過表達miR-29c的SNB19膠質(zhì)瘤亞細胞系(p-miR29c)及對照無義序列過表達亞細胞系(p-scr)，觀察miR29c對惡性膠質(zhì)瘤細胞CDK6 mRNA和蛋白表達及細胞周期分布和增殖活性的影響，探索miR-29s抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖的分子機制。
　　 結(jié)果: ①原位雜交結(jié)果顯示，WHOⅠ～Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級膠質(zhì)瘤組的miR-29a陽性標記指數(shù)(LI％)分別為21.30±18.20、4

7、.53±2.54、1.46±0.52，并均明顯低于非腫瘤對照腦組織的LI％（46.37±26.38，P＜0.001）;miR-29b陽性標記指數(shù)(LI％)分別為17.37±12.87、5.06±2.87、1.49±0.71，并均明顯低于非腫瘤對照腦組織的LI％（39.89±26.76，P＜0.001）;miR-29c陽性標記指數(shù)(LI％)分別為18.93±11.94、5.54±3.81、1.77±0.95，并均明顯低于非腫瘤對照腦組織的

8、LI％（53.66±23.66，P＜0.001）;miR-29a/b/c表達水平隨著膠質(zhì)瘤良惡性級別的升高相應(yīng)降低，各組之間的差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。而Ki-67表達水平則呈相反趨勢，對照腦組織的Ki-67陽性細胞密度最低（0.00±0.00），且其表達水平隨膠質(zhì)瘤良惡性級別增加相應(yīng)升高(WHOⅠ～Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級組分別為9.30±3.48、31.15±9.44、60.15±13.60);各組間的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0

9、.01）。經(jīng)直線相關(guān)分析證實，miR-29a/b/c與Ki-67指標之間呈顯著性負相關(guān)(r=-586、r=-625、r=-599，P＜0.01)。②熒光素酶實驗結(jié)果顯示，在膠質(zhì)瘤細胞里，miR-29s可通過與野生型CDC42的3'UTR特異性結(jié)合，介導其對熒光素酶報導基因表達的沉默作用;因miR-29s變型CDC423'UTR結(jié)合，當用二者共轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞時不能沉默熒光素酶報導基因的表達;從而證實CDC42是miR-29s的天然靶基因。

10、與相應(yīng)的對照組細胞相比，miR-29s轉(zhuǎn)染組細胞的miR-29a/b/c表達水平明顯升高，而CDC42 mRNA及蛋白表達水平均明顯降低，說明miR-29a/b/c可以通過直接降解CDC42mRNA阻斷CDC42表達。③遷移、侵襲實驗結(jié)果顯示，miR-29家族可有效抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞系的遷移和侵襲能力，外源性CDC42可部分逆轉(zhuǎn)miR-29s對腫瘤細胞遷移侵襲的影響;④miR-29mix轉(zhuǎn)染組細胞Ki-67陽性標記指數(shù)LI(％)和克隆

11、形成效率均明顯低于對照組細胞，補充CDC42后可部分逆轉(zhuǎn)miR-29mix mimics轉(zhuǎn)染細胞的LI(％)。⑤miR-29mix轉(zhuǎn)染的U87MG(p53野生型）細胞Caspase3/7活性明顯高于對照組細胞，F(xiàn)CM中miR-29mix mimics轉(zhuǎn)染的U87MG細胞其凋亡指數(shù)明顯高于對照組細胞。外源性CDC42可部分降低miR-29mix mimics轉(zhuǎn)染U87MG細胞的Caspase3/7活性及凋亡指數(shù)。而miR-29mix mi

12、mics轉(zhuǎn)染的U251（p53突變型）各細胞Caspase3/7活性及凋亡指數(shù)與對照組細胞相比無顯著性差異。⑥與SNB19及SNB19-scr相比，SNB19-miR-29c G0/G1期細胞比例明顯增高，而S期及G2/M期比例相應(yīng)降低，同時SNB19-miR-29c的克隆形成效率亦明顯低于兩個對照（亞）細胞系。
　　 結(jié)論: ①隨著膠質(zhì)瘤惡性度的升高，miR-29a/b/c表達水平降低，而CDC42表達水平增加，二者呈顯著負相

13、關(guān)，miR-a/b/c和CDC42表達水平可作為評價膠質(zhì)瘤生物學行為及患者預(yù)后的重要參考指標。②研究轉(zhuǎn)染miR-29a、miR-29b、miR-29c及miR-29mix過表達細胞系可相應(yīng)高表達miR-29a、miR-29b、miR-29c及miR-29mix，是研究miR-a/b/c抑瘤效應(yīng)的理想細胞模型③CDC42是miR-29a、miR-29b、miR-29c的天然靶基因，miR-29a、miR-29b、miR-29c可通過降解其