異硫代氰酸酯抗癌活性及MTBITC誘導(dǎo)A549細(xì)凋亡機(jī)理的研究.pdf

1、近年來，肺癌的發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)呈不斷上升趨勢(shì)，其中80％-85％表現(xiàn)為非小細(xì)胞肺癌。流行病學(xué)研究表明，十字花科蔬菜的攝入可降低癌癥的患病率，其最有效成分為硫代葡萄糖苷(簡(jiǎn)稱硫苷)的降解產(chǎn)物-異硫代氰酸酯(ITCs)。目前，對(duì)十字花科蔬菜中ITCs的研究主要集中在組分分析及含量的測(cè)定，而對(duì)其單體的分離研究較少；ITCs的結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系尚不明確；其誘導(dǎo)腫瘤凋亡機(jī)制尚未見詳盡報(bào)道。萊菔素(MTBITC)誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌A54

2、9細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及作用機(jī)理的研究尚未見報(bào)道。
　　 本論文以分離得到的5個(gè)ITCs為研究對(duì)象，對(duì)其體外抗腫瘤活性進(jìn)行了藥效學(xué)評(píng)價(jià)，并從量子化學(xué)角度分析了其結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系。并以人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞為靶細(xì)胞，研究了MTBITC誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的機(jī)理。主要研究結(jié)論如下：
　　 1、為優(yōu)化硫苷的酶解條件，以一點(diǎn)紅蘿卜種子為研究對(duì)象，MTBITC得率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化確定最佳酶解條件為：酶解溫度25℃，酶

3、解時(shí)間8h,Vc添加量0.06mg/g，酶解pH值為3.71。MTBITC的實(shí)際得率為3.53mg/g。
　　 2、采用丙酮提取，利用多種現(xiàn)代色譜技術(shù)(硅膠柱層析，Sephadex LH-20凝膠色譜，高效液相制備等)從一點(diǎn)紅蘿卜、澄海粗條芥藍(lán)、牛心甘藍(lán)、西蘭花種子中分離得到了5個(gè)ITCs，分別鑒定為萊菔素(MTBITC)(Ⅰ)、3-(甲硫基)丙基異硫代氰酸酯(Iberverin)(Ⅱ)、蘿卜硫素(Sulforaphane)(Ⅲ

4、)、3-(甲磺?；?丙基異硫代氰酸酯(Iberin)(Ⅳ)和3-丁烯基異硫代氰酸酯(3-BITC)(Ⅴ)。
　　 3、對(duì)5個(gè)ITCs體外抗腫瘤活性的藥效學(xué)評(píng)價(jià)表明，MTBITC、Sulforaphane和Iberin對(duì)人肺癌A549和LAC、人肝癌HepG2、人宮頸癌HELA細(xì)胞均有明顯的抑制作用。A549細(xì)胞對(duì)MTBITC的敏感性最強(qiáng)；MTBITC, Sulforaphane和Iberin對(duì)HepG2、LAC和HELA細(xì)胞的抑

5、制作用相似，但明顯強(qiáng)于Iberverin和3-BITC。
　　 4、基于DMol3模塊，從量子化學(xué)角度對(duì)5個(gè)ITCs進(jìn)行幾何構(gòu)型優(yōu)化，在此結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行Mulliken電荷分布及前線軌道能量計(jì)算，分析了ITCs的活性位點(diǎn)，及其抗癌活性與電子結(jié)構(gòu)的關(guān)系。結(jié)果表明，ITCs的特征基團(tuán)N=C=S中間C原子作為親電位點(diǎn)，側(cè)鏈上的磺酰基和硫基為輔助位點(diǎn)，使其具有一定的抗癌活性。ITCs的抗癌活性差異與ITCs分子的負(fù)電荷分布、前線分子軌道

6、的離域性及最低未占據(jù)軌道能量和最高占據(jù)軌道能量的差值(△EL-H)有關(guān)。
　　 5、MTBITC以劑量-時(shí)間依賴性抑制A549細(xì)胞增殖，其抑制腫瘤細(xì)胞增殖主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而非壞死。形態(tài)學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)MTBITC使A549細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)；PI單染和AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)分析，表明A549細(xì)胞經(jīng)MTBITC處理后出現(xiàn)明顯的凋亡峰，細(xì)胞周期阻滯于S期和G2/M期，細(xì)胞以早期凋亡為主，呈劑量依賴性。分子對(duì)接研究

7、表明，MTBITC與微管蛋白疏水區(qū)域內(nèi)部的Cys347殘基以共價(jià)鍵結(jié)合，與Lys352殘基以氫鍵結(jié)合，說明MTBITC通過影響微管蛋白的價(jià)鍵，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 6、采用RT-PCR法、流式細(xì)胞術(shù)、Caspase分光光度檢測(cè)法等，分析凋亡過程中相關(guān)基因mRNA表達(dá)情況，檢測(cè)線粒體膜電位(ΔΨm)、活性氧(ROS)、Ca2+濃度及Caspase-3、-8、-9的變化，探討MTBITC誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的機(jī)理。結(jié)果

8、顯示，MTBITC使△Ψm降低，細(xì)胞內(nèi)游離的ROS和Ca2+濃度含量升高，Bcl-2、Bcl-xL的mRNA表達(dá)下調(diào)，Bax和Bid mRNA表達(dá)上調(diào)，Caspase-9被激活，且具有時(shí)間依賴性，說明線粒體途徑和Bcl-2基因家族參與了MTBITC誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的調(diào)控。同時(shí)，MTBITC使細(xì)胞Fas、FasL、FADD mRNA表達(dá)增強(qiáng)，Caspase-8，-3活性升高，且具有時(shí)間依賴性，表明MTBITC通過Fas途徑引起A549