協(xié)同信號分子B7-H3對肺炎鏈球菌腦膜炎小鼠腦損傷的影響.pdf

1、實驗?zāi)康?
　　細(xì)菌性腦膜炎是兒童時期較嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病,近年來,盡管給予有效的抗生素治療,但是細(xì)菌性腦膜炎仍有較高的死亡率和致殘率,因此進(jìn)一步研究細(xì)菌性腦膜炎的免疫病理機(jī)制,尋找新的免疫干預(yù)手段意義重大。細(xì)菌性腦膜炎導(dǎo)致血腦屏障破壞和腦組織損傷,而腦組織損傷的嚴(yán)重程度決定了細(xì)菌性腦膜炎患者的預(yù)后。有諸多研究已證實在細(xì)菌性腦膜炎時腦內(nèi)神經(jīng)元會發(fā)生壞死、凋亡等改變。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific e

2、nolase,NSE)和S100b已經(jīng)被證實是腦損傷的特異性標(biāo)志物,誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)能夠生物合成(nitric oxide,NO),它已經(jīng)被證實在細(xì)菌性腦膜炎引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡中扮演者重要角色。協(xié)同信號分子是介導(dǎo)抗感染免疫應(yīng)答過程的重要成分,B7同源性3(B7 Homology3,B7-H3)是B7家族的新成員,它在抗感染免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的免疫調(diào)控作用。

3、我們前期研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌性腦膜炎患兒體內(nèi)可溶性B7-H3分子異常高表達(dá),此外還發(fā)現(xiàn)在小鼠肺炎鏈球菌(S. Pneumoniae,SP)腦膜炎模型中B7-H3加劇了SP腦膜炎的病理損傷(血腦屏障的破壞),增強(qiáng)了炎癥趨化作用。本研究是在以上前期工作的基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察分析B7-H3對細(xì)菌性腦膜炎動物模型腦組織中神經(jīng)元壞死、腦細(xì)胞凋亡的影響,以及對腦損傷標(biāo)志物NSE、S100b、iNOS表達(dá)的影響,探討B(tài)7-H3對細(xì)菌性腦膜炎小鼠腦損傷的影響,了解

4、其在細(xì)菌性腦膜炎病情進(jìn)展中的作用,以期為細(xì)菌性腦膜炎的免疫干預(yù)提供新的思路和實驗依據(jù)。
　　實驗方法:
　　1、研究B7-H3對SP腦膜炎小鼠神經(jīng)行為學(xué)改變、體質(zhì)量的變化的影響,取月齡為1.5-2月的健康雄性BALB/C小鼠48只,隨機(jī)分為4組:生理鹽水對照組(CON組)、B7-H3組(B7-H3組)、肺炎鏈球菌組(SP組)、肺炎鏈球菌+B7-H3蛋白組(SP+B7-H3組);每組12只小鼠。腹腔注射誘導(dǎo)麻醉后,通過側(cè)腦室定

5、位注入10ul無菌生理鹽水+5ul肺炎鏈球菌混懸液來建立小鼠細(xì)菌性腦膜炎模型;CON組注射15ul無菌生理鹽水,B7-H3組注入10ul濃度為0.33μg?ul-1B7-H3蛋白+5ul無菌生理鹽水, SP組注入10ul無菌生理鹽水+5ul肺炎鏈球菌混懸液,SP+B7-H3組注入10ul濃度為0.33μg?ul-1B7-H3蛋白+5ul肺炎鏈球菌混懸液。
　　2、分別于側(cè)腦室注射后18h、48h、72h對各組小鼠進(jìn)行:1)神經(jīng)行為

6、學(xué)評分、2)記錄體質(zhì)量的變化(分別記錄注射前后在不同時間點小鼠的體重,分析前后體重差值的變化)。研究B7-H3對SP腦膜炎小鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞丟失(Nissl染色)和腦組織細(xì)胞凋亡(Tunel染色)的影響,評價腦損傷情況。關(guān)于動物模型及分組同實驗方法1.分別于側(cè)腦室注射后18h、48h、72h檢測小鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞的丟失和凋亡。(通過顯微鏡觀察不同時間點小鼠腦組織中尼氏染色陽性細(xì)胞及凋亡陽性細(xì)胞數(shù)量的改變)。
　　3、分析B7-

7、H3對SP腦膜炎小鼠腦組織勻漿中腦損傷標(biāo)志物NSE,S100b mRNA相對表達(dá)量及NSE,S100b,iNOS蛋白表達(dá)的影響,關(guān)于動物模型及分組同實驗方法1。分別于側(cè)腦室注射后18h、48h、72h對小鼠進(jìn)行1)Real-time PCR方法檢測腦組織勻漿中腦損傷標(biāo)志物NSE,S100b mRNA的相對表達(dá)量、2)免疫組織化學(xué)方法檢測腦組織中NSE,S100b,iNOS蛋白的表達(dá)。
　　實驗結(jié)果:
　　一、B7-H3對SP

8、腦膜炎小鼠臨床癥狀的影響
　　1、神經(jīng)行為學(xué)評分:分別記錄各組小鼠側(cè)腦室注射后18h、48 h、72h時的臨床評分。B7-H3組與CON組小鼠臨床評分:18h(5.0±0)vs(5.0±0)、48h(5.0±0) vs(5.0±0)、72h(5.0±0)vs(5.0±0),差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);SP組在18h、48 h、72h臨床評分較CON組均明顯降低:18h(4.5±0.57)vs(5.0±0)、48h(3.5±

9、0.57)vs(5.0±0)、72h(2.75±0.5)vs(5.0±0),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);SP+B7-H3組在18h、48 h、72h臨床評分均明顯低于CON組:18h(4.0±0)vs(5.0±0)、48h(3.0±0)vs(5.0±0)、72h(1.75±0.5)vs(5.0±0),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),且SP+B7-H3組與SP組相比進(jìn)一步降低:18h(4.0±0)vs(4.5±0.57)、48

10、h(3.0±0)vs(3.5±0.57)、72h(1.75±0.5)vs(2.75±0.5),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　2、體質(zhì)量變化:分別記錄各組小鼠側(cè)腦室注射前和注射后18h、48h、72h體質(zhì)量的變化。B7-H3組與CON組小鼠在18h、48h、72h體質(zhì)量變化:18h(-0.01±0.24) vs(-0.05±0.42)、48h(-0.02±0.12)vs(-0.28±0.34)、72h(-0.02±0.1

11、3)vs(-0.07±0.4),兩組間體質(zhì)量變化無顯著差異(P>0.05);SP組接種細(xì)菌后18h、48h、72h時體重相對于CON組均降低:18h(0.8±0)vs(-0.05±0.42)、48h(1.48±0.05) vs(-0.28±0.34)、72h(2.53±0.07)vs(-0.07±0.4),差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);SP+B7-H3組小鼠在接種細(xì)菌和蛋白混懸液后體重明顯低于CON組:18h(1.5±0.17)

12、 vs(-0.05±0.42)、48h(2.0±0.02)vs(-0.28±0.34)、72h(3.23±0.12)vs(-0.07±0.4)(P<0.05),SP+B7-H3組與SP組相比亦明顯降低:18h(1.5±0.17)vs(0.8±0)、48h(2.0±0.02)vs(1.48±0.05)、72h(3.23±0.12)vs(2.53±0.07),差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　二、B7-H3對SP腦膜炎小鼠腦

13、組織中神經(jīng)細(xì)胞的壞死和凋亡的影響。
　　1、Nissl染色四組小鼠腦組織中均有染色陽性的細(xì)胞,在腦組織中,B7-H3組尼氏染色陽性的神經(jīng)元細(xì)胞與CON組比較無明顯差異18h(113.33±5.77)vs(115.0±5.0)、48h(113.0±1.0)vs(113.0±2.65)、72h(108.67±3.21)vs(107.67±3.21),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);SP組與CON組比較陽性細(xì)胞數(shù)量減少18h(105.

14、0±5.0) vs(115.0±5.0)、48h(94.33±4.04)vs(113.0±2.65)、72h(89.33±0.58)vs(107.67±3.21),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);SP+B7-H3組18h、48h、72h與CON組比較明顯降低18h(90.0±1.0)vs(115.0±5.0),48h(82.0±2.65)vs(113.0±2.65)、72h(81.33±2.31)vs(107.67±3.21),差異

15、具有顯著性(P<0.01);同時還發(fā)現(xiàn),在18h、48h、72h三個時間點SP+B7-H3組陽性細(xì)胞數(shù)目均低于SP組(90.0±1.0)vs(105.0±5.0)、(82.0±2.65)vs(94.33±4.04)、72h(81.33±2.31)vs(89.33±0.58),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　2、Tunel染色在腦組織中,B7-H3組Tunel染色陽性的凋亡細(xì)胞與CON組比較無明顯差異18h(0.67±0.5

16、7)vs(1.33±0.57)、48h(0.68±0.57)vs(0.67±0.58)、72h(1.0±1.0)vs(0.33±0.58),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);SP組與CON組比較凋亡細(xì)胞增多18h(11.33±1.53)vs(1.33±0.57)、48h(19.0±1.0)vs(0.67±0.58)、72h(26.32±1.54)vs(0.33±0.58),差異具有顯著性(P<0.01);SP+B7-H3組18h、48h

17、、72h與CON組比較凋亡細(xì)胞增多更明顯18h(17.67±2.08)vs(1.33±0.57),48h(26.33±1.53)vs(0.67±0.58)、72h(38.0±2.65)vs(0.33±0.58),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);同時發(fā)現(xiàn)在18h、48h、72h三個時間點SP+B7-H3與SP組比較凋亡細(xì)胞亦增多18h(17.67±2.08)vs(11.33±1.53),48h(26.33±1.53)vs(19.0±1

18、.0)、72h(38.00±2.65)vs(26.32±1.54)(P<0.05)。
　　三、B7-H3對SP腦膜炎小鼠腦組織中腦損傷標(biāo)志物及iNOS的影響
　　1、Real-time PCR檢測腦組織勻漿中NSE,S100b mRNA的相對表達(dá)量:我們發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌注射18h、48h、72h后,B7-H3組和CON組的NSE mRNA表達(dá),18h(0.052±0.034)vs(0.028±0.01)、48h(0.02±0.00

19、1)vs(0.028±0.003)、72h(0.036±0.002)vs(0.028±0.001),差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);細(xì)菌注射后18h時NSE mRNA相對表達(dá)量,SP組較CON組明顯升高(0.095±0.03)vs(0.028±0.01),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); SP+B7-H3組較SP組明顯升高(0.124±0.049)vs(0.095±0.03),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)菌注射后48h時

20、NSE mRNA相對表達(dá)量,SP組較CON組明顯升高(0.177±0.021)vs(0.028±0.003),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),SP+B7-H3組較SP組明顯升高(0.33±0.088)vs(0.177±0.021),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);細(xì)菌注射后72h時NSE mRNA相對表達(dá)量,SP組較CON組明顯升高(0.369±0.035)vs(0.028±0.001),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), S

21、P+B7-H3組較SP組明顯升高(0.529±0.02)vs(0.369±0.035),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　在細(xì)菌注射后B7-H3組和CON組的S100bmRNA表達(dá),18h(0.04±0.018)vs(0.03±0.006)、48h(0.029±0.003)vs(0.029±0.002)、72h(0.048±0.001)vs(0.046±0.002),差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);細(xì)菌注射后18h時S1

22、00b mRNA相對表達(dá)量,SP組較CON組升高(0.061±.006)vs(0.03±0.006),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),SP+B7-H3組較SP組升高(0.148±0.052)vs(0.061±.006),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);細(xì)菌注射后48h時S100b mRNA的相對表達(dá)量,SP組較CON組升高(0.185±0.012)vs(0.029±0.002),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), SP+B7-H3

23、組較SP組升高(0.194±0.018)vs(0.185±0.012),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);細(xì)菌注射后72h時S100b mRNA的相對表達(dá)量,SP組較CON組明顯升高(0.284±0.008)vs(0.046±0.002),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),SP+B7-H3組較SP組明顯升高(1.62±0.118)vs(0.284±0.008),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　2、腦組織免疫組織化學(xué)結(jié)

24、果分析:
　　2.1腦組織中NSE蛋白的表達(dá):在腦組織中,各組小鼠均有NSE陽性細(xì)胞表達(dá),光鏡下為胞內(nèi)基質(zhì)有棕褐色顆粒沉積。我們發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌注射后18h、48h、72h,B7-H3組與CON組比較NSE陽性細(xì)胞數(shù)目無明顯差異:18h(100.0±4.58)vs(99.67±0.58)、48h(100.33±0.58)vs(99.66±2.08)、72h(99.67±2.31)vs(100.0±2.0),差異無統(tǒng)計學(xué)意義,(P>0.0

25、5);SP組NSE陽性細(xì)胞數(shù)與CON組比較明顯減少18h(96.67±1.53)vs(99.67±0.58)、48h(82.0±2.65)vs(99.66±2.08)、72h(75.33±0.58) vs(100.0±2.0),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SP+B7-H3組NSE陽性細(xì)胞數(shù)與CON組比較在18h、48h、72h三個時間點均明顯減少(86.67±2.89)vs(99.67±0.58)、(66.0±5.29)vs(99

26、.66±2.08)、(55.0±5.0)vs(100.0±2.0),差異具有顯著性(P<0.01)。同時我們還發(fā)現(xiàn),在18h、48h、72h三個時間點SP+B7-H3組NSE陽性細(xì)胞數(shù)目均少于SP組(86.67±2.89)vs(96.67±1.53)、(66.0±5.29)vs(82.0±2.65)、(55.0±5.0) vs(75.33±0.58),差異具有顯著性(P<0.05)。
　　2.2腦組織中S100b蛋白的表達(dá):在腦組

27、織中，各組小鼠均有S100b陽性細(xì)胞表達(dá)。在B7-H3組、CON組18h、48h、72h均出現(xiàn)S100b免疫組化反應(yīng)陽性，但陽性細(xì)胞數(shù)無明顯差異18h（23.45±1.98）vs（23.54±2.3）、48h（23.67±2.32）vs（23.53±2.12）、72h（23.78±2.34）vs（23.76±1.32）（P0.05），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）；SP組S100b表達(dá)較CON組明顯升高，18h（30.1±3.21）vs

28、（23.54±2.3）、48h（38.23±3.23）vs（23.53±2.12）、72h（43.12±1.33）vs（23.76±1.32），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）；SP+B7-H3組S100b表達(dá)與CON組比較升高更明顯18h（40.6±1.45）vs（23.54±2.3）、48h（55.34±1.53）vs（23.53±2.12）、72h（68.12±2.89）vs（23.76±1.32），差異具有顯著性（P0.01）

29、；同時我們還發(fā)現(xiàn)，在18h、48h、72h三個時間點，SP+B7-H3組S100b表達(dá)均高于SP組，18h（40.6±1.45）vs（30.1±3.21）、48h（55.34±1.53）vs（38.23±3.23）、72h（68.12±2.89）vs（43.12±1.33），（P0.05）。
　　2.3腦組織中iNOS蛋白的表達(dá)：在腦組織中，用PBS替代一抗作為陰性對照，陰性對照未見免疫組化iNOS陽性染色顆粒；B7-H3組與CO

30、N組幾乎都無iNOS的表達(dá)。SP組iNOS表達(dá)與CON組比較明顯升高，18h（29.33±1.15）vs（0.0±0.0）、48h（45.0±5.0）v（s1.0±0.0）、72h（71.67±2.89）v（s0.0±0.0），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）；SP+B7-H3組iNOS表達(dá)較CON組升高更明顯，18h（35.33±0.58）vs（0.0±0.0）、48h（56.33±1.53）vs（1.0±0.0）、72h（81.6

31、7±2.89）vs（0.0±0.0），差異均具有顯著性（P0.01）；同時我們還發(fā)現(xiàn)，在18h、48h、72h三個時間點SP+B7-H3組iNOS表達(dá)均高于SP組，18h（35.33±0.58）vs（29.33±1.15）、48h（56.33±1.53）vs（45.0±5.0）、72h（81.67±2.89）vs（71.67±2.89），差異均具有顯著性（P0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、本實驗經(jīng)側(cè)腦室注射肺炎鏈球菌混懸液

32、，成功建立了小鼠SP腦膜炎模型。
　　2、本實驗結(jié)果顯示：在SP腦膜炎模型中，小鼠臨床評分降低，體重減輕，腦組織中Nissl染色陽性的神經(jīng)元細(xì)胞減少，Tunel染色陽性凋亡細(xì)胞增多；腦損傷標(biāo)志物分子NSE，S100b mRNA相對表達(dá)量及S100b，iNOS蛋白表達(dá)量升高，NSE蛋白陽性細(xì)胞在腦組織中減少，這些結(jié)果表明，SP腦膜炎小鼠模型發(fā)生了腦損傷。
　　3、協(xié)同信號分子B7-H3加劇了SP腦膜炎的臨床癥狀，促進(jìn)了腦組織神