α1-抗胰蛋白酶對白蛋白-胰島素結合抑制作用及其機制.pdf

1、第一部分α1抗胰蛋白酶對白蛋白-胰島素結合力及其對血糖的條件作用
　　糖尿病是一種以血糖代謝紊亂為特點的常見慢性疾病，其中90％以上為2型糖尿病(type2 diabetes，T2DM)。近年來研究發(fā)現胰島素抵抗在2型糖尿病發(fā)病中起重要作用，并貫穿于2型糖尿病全過程。關于胰島素抵抗的發(fā)生機制尚不完全清楚，各種實驗研究結果顯示，胰島素抵抗的發(fā)生多是與炎癥反應、激素因子作用、內質網應激以及過量的營養(yǎng)產物在胰島素敏感組織堆積等共同作用有

2、關。妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指在妊娠期首次發(fā)生或發(fā)現的不同程度的糖代謝異常。GDM發(fā)病機制至今尚不清楚，它由多種因素作用所致，胰島素抵抗和胰島β細胞分泌降低是GDM發(fā)病機制的重要環(huán)節(jié)。
　　白蛋白是最主要的血漿蛋白之一，在大量內源性和外源性物質的結合和轉運方面發(fā)揮重要的作用。白蛋白具有胰島素樣或是抑制胰島素樣活性，而且血清中的胰島素大多與血清蛋白相結合。我們之前的研究結果

3、表明:首先，在血清中存在兩種不同形式的胰島素即游離胰島素和結合胰島素。游離胰島素作為活性形式而結合胰島素作為非活性形式存在;其次，血清白蛋白作為胰島素的轉運體和存儲體;最后，白蛋白和胰島素的結合與解離可以調節(jié)血糖水平和細胞功能。根據以上三點，我們提出胰島素抵抗發(fā)生機制的新設想:我們假設游離胰島素是作為可供機體立即利用的活性形式，結合胰島素則處于非活性狀態(tài)，但可從結合蛋白質中分離從而保持游離胰島素水平的穩(wěn)定。在某些病理狀態(tài)下，例如高脂血癥

4、和肥胖時，這種平衡可以發(fā)生改變。如果血清白蛋白-胰島素結合力增加，則可供利用的游離胰島素水平降低;相反，如果血清白蛋白-胰島素結合力降低，由于游離胰島素半衰期很短，則可供利用的游離胰島素水平在餐后上升而在空腹水平時下降。不論是在哪種條件下，胰腺都要分泌更多的胰島素以維持血糖在空腹和餐后狀態(tài)下的正常水平。如果這種補償機制失衡，則正常的空腹血糖水平無法維持。因此，在我們接下來的研究中，將會著重探索影響白蛋白-胰島素結合力的未知的病理因素及其

5、是如何發(fā)揮作用的，從而為我們所提出的胰島素抵抗的新設想以至糖尿病的發(fā)生機制提供進一步的理論依據。我們的實驗主要分為兩部分:
　　第Ⅰ部分:2型糖尿病與妊娠期糖尿病的蛋白質組學研究。我們采用2型糖尿病病人和妊娠期糖尿病病人分別與其對照者的血清進行蛋白質組學研究，篩選出這兩組病人與其對照在血清蛋白表達上的共同點，發(fā)現可能影響白蛋白-胰島素結合力的重要因子。12例2型糖尿病病人和10例匹配對照者的血清以及9例妊娠期糖尿病病人和8例匹配對

6、照者的血清用來進行雙向電泳，隨后用軟件對圖譜進行分析和匹配，并對在兩組中發(fā)生相同顯著差異變化的4種蛋白質進行質譜鑒定。結果顯示:2型糖尿病病人和對照者血清蛋白質雙向電泳圖譜進行圖像分析和匹配后發(fā)現，兩種圖譜的蛋白點數分別為465±11和423±15，其中共有269個蛋白點相互匹配，匹配率平均為61％。在這些匹配的蛋白點中，共有19個蛋白點發(fā)生顯著性差異變化（以3倍變化幅度為基準），其中在2型糖尿病中表達上調的蛋白點有8個，表達下調的蛋白

7、點有11個。對妊娠期糖尿病病人和其對照者血清蛋白質雙向電泳圖譜進行分析和匹配后發(fā)現，兩種圖譜的蛋白點數分別為325±18和342±10，其中共有197個蛋白點相互匹配，匹配率平均為59％。在這些匹配的蛋白點中，共有30個蛋白點發(fā)生顯著性差異變化（以3倍變化幅度為基準），其中在妊娠期糖尿病中表達上調的蛋白點有19個，表達下調的蛋白點有11個。綜合分析上述發(fā)生變化的蛋白點，我們發(fā)現有2個蛋白點在2型糖尿病和妊娠期糖尿病病人血清中均表達上調，

8、同時也有2個蛋白點在這兩組病人血清中均表達下調。對這4種蛋白點的質譜鑒定結果顯示它們分別為α1抗胰蛋白酶、血管緊張素原、凝集素和人血白蛋白與十四酸和三碘苯甲酸的復合物。其中α1抗胰蛋白酶和血管緊張素原在兩組糖尿病中表達下降，與對照組的相對表達量分別是-3.82±0.73和-4.76±0.33;而凝集素和人血白蛋白與十四酸和三碘苯甲酸的復合物在兩組糖尿病中表達上升，與對照組的相對表達量分別是15.6±2.49和3.13±0.23。

9、　　第Ⅱ部分:α1抗胰蛋白酶對白蛋白-胰島素結合力的影響。在第Ⅰ部分的實驗中，我們研究發(fā)現了在兩組糖尿病病人中發(fā)生改變的4種蛋白質，其中α1抗胰蛋白酶在血清中的數量級最高，與白蛋白的分子數最為匹配，預計對白蛋白的結合或解離狀態(tài)影響最大，因此，我們選擇α1抗胰蛋白酶作為研究對象，觀察其在影響白蛋白-胰島素結合力方面所發(fā)揮的作用。首先，我們用免疫共沉淀的方法去證明血清中白蛋白和α1抗胰蛋白酶的結合。用α1抗胰蛋白酶的抗體去沉淀與之結合的蛋白

10、，非特異IgG作為對照。結果顯示在α1抗胰蛋白酶抗體組可明顯檢測到α1抗胰蛋白酶，同時也可以檢測到大量白蛋白;在非特異IgG組則未發(fā)現有α1抗胰蛋白酶。然后，我們用體外實驗證明不同濃度α1抗胰蛋白酶對白蛋白-胰島素結合力的影響。結果顯示:與正常濃度α1抗胰蛋白酶/白蛋白組相比，低濃度α1抗胰蛋白酶明顯增加了結合胰島素/游離胰島素的比值(2.41±0.17 vs1.76±0.20，P=0.0024);低濃度α1抗胰蛋白酶/白蛋白組和高濃度

11、α1抗胰蛋白酶/白蛋白組之間該比值更加明顯(2.41±0.17 vs1.53±0.18，P=0.0004);而正常濃度α1抗胰蛋白酶/白蛋白組和高濃度α1抗胰蛋白酶/白蛋白組之間該比值沒有統計學意義(P=0.1406)。
　　接下來，我們觀察了白蛋白和胰島素對小鼠血清α1抗胰蛋白酶濃度的影響。結果發(fā)現在α1抗胰蛋白酶/白蛋白低于正常時，注射白蛋白可提高血清α1抗胰蛋白酶濃度，而α1抗胰蛋白酶/白蛋白正?；蛘吒哂谡r，白蛋白對α1

12、抗胰蛋白酶濃度無影響。相反，注射胰島素可顯著降低注射PBS或者少量（0.64mg/ml）α1抗胰蛋白酶小鼠的血清α1抗胰蛋白酶濃度。由于免疫共沉淀結果顯示血清中胰島素與α1抗胰蛋白酶不結合，這就提示胰島素與α1抗胰蛋白酶競爭結合白蛋白。
　　我們進一步觀察白蛋白/α1抗胰蛋白酶比值對血糖濃度的影響，結果顯示:低α1抗胰蛋白酶(0.64mg/ml)/白蛋白比值組中小鼠的血糖水平明顯升高，阻止了胰島素誘導的低血糖反應。將注射液的α1抗

13、胰蛋白酶的濃度增加到2.58mg/ml和10.30mg/ml后，胰島素誘導的低血糖反應則出現加大且延長。α1抗胰蛋白酶的濃度與血糖水平的變化呈現出負相關關系。注射不含白蛋白的α1抗胰蛋白酶溶液則與注射正常和高α1抗胰蛋白酶/白蛋白比值組類似。因此，我們認為α1抗胰蛋白酶通過抑制白蛋白和胰島素的結合來發(fā)揮降血糖的作用。
　　我們首次發(fā)現α1抗胰蛋白酶可通過與胰島素競爭結合白蛋白，促使胰島素從胰島素-白蛋白復合物中解離和利用，從而調節(jié)

14、血糖水平。低α1抗胰蛋白酶血癥可能是2型糖尿病和妊娠期糖尿病胰島素抵抗的重要機制，為糖尿病的發(fā)生和發(fā)展提供了新的機制，具有臨床潛在應用價值。
　　第二部分 apoE基因敲除小鼠心臟中動脈粥樣硬化相關基因表達節(jié)律改變的研究
　　晝夜節(jié)律生物鐘(circadian clock)參與調控機體行為與各項生理功能。晝夜節(jié)律的產生依賴于各種生物鐘基因(clock gene)的轉錄-翻譯反饋環(huán)路。鐘基因可以通過調節(jié)下游的鐘控基因(CCGs

15、)調節(jié)多項生理功能。研究表明，晝夜節(jié)律生物鐘不僅參與生理功能的調節(jié)，在多種病理過程中如心血管系統疾病、腫瘤中也發(fā)揮了重要的作用。
　　急性心肌梗塞(Acute Myocardial Infarction，AMI)是動脈粥樣硬化的終末病變，其發(fā)病具有明確的晝夜節(jié)律，在早晨高發(fā)。目前對這種現象發(fā)生的機制還未研究清楚，但可能與晝夜節(jié)律生物鐘有關。本研究將利用apoE基因敲除（apoE-/-）小鼠建立動脈粥樣硬化模型，以研究動脈粥樣硬化發(fā)

16、病過程中動脈粥樣硬化相關基因:纖溶酶原激活物(t-PA)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(Pai-1)、組織因子(TF)、內皮素-1(ET-1)和基質金屬蛋白酶（MMP-1、MMP-2及MMP-9）的晝夜節(jié)律表達變化，為研究動脈粥樣硬化的發(fā)病機制提供新的理論依據。
　　apoE-/-小鼠心臟動脈粥樣硬化相關基因表達節(jié)律的改變。利用apoE-/-小鼠建立動脈粥樣硬化早期及進展期動物模型。使用3月齡apoE-/-小鼠48只，分為兩組，每組2

17、4只，一組給予普通膳食，一組西方類型膳，以24只同齡雄性C57BL/6J作為對照，在12光照/12黑暗(12L/12D)環(huán)境中飼養(yǎng)4周。根據Zeitgaber Time，分別在ZT0、ZT4、ZT8、ZT10、ZT12、ZT14、ZT16、ZT20八個時間點處死小鼠;取小鼠主動脈起始段做冰凍切片，油紅O染色檢測動脈粥樣斑塊;取小鼠心臟液氮速凍，-70℃冰箱保存。利用Real-time RCR檢測apoE-/-與C57BL/6J小鼠心臟動

18、脈粥樣硬化相關基因t-PA、Pai-1、TF、ET-1和MMP-1、MMP-2及MMP-9在不同時間點的表達變化。結果顯示給予了普通膳食的apoE-/-小鼠尚未形成明顯的粥樣斑塊，但其主動脈內皮下已經形成泡沫細胞;給予西方類型膳的apoE-/-小鼠主動脈有明顯的動脈粥樣硬化斑塊出現，油紅O染色顯示粥樣斑塊內存在明顯的脂質沉積。因此，給予普通膳食與西方類型膳的apoE-/-小鼠分別處于動脈粥樣硬化的早期與進展期。Real-time PCR

19、結果顯示C57BL/6J小鼠心臟中Pai-1，t-PA，TF和ET-1的表達高峰出現在ZT14和ZT16之間，表達低谷出現在ZT10;在給予普通膳食的apoE-/-小鼠中三者表達失去了節(jié)律;而在給予西方類型膳的apoE-/-小鼠中表達高峰在ZT4，表明三者表達節(jié)律出現完全相反的變化。在C57BL/6J小鼠和apoE-/-小鼠心臟中MMP-1、MMP-2及MMP-9三種基因的表達均未出現明顯的節(jié)律變化。
　　綜上所述，我們首次發(fā)現a