α1-抗胰蛋白酶對體外循環(huán)術(shù)后急性肺損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass，CPB)技術(shù)自二十世紀(jì)五十年代成功用于臨床以來，已成為心內(nèi)直視手術(shù)的必備手段，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，體外循環(huán)機(jī)器和相關(guān)管道材料的改良，術(shù)中心肌保護(hù)、灌注技術(shù)以及圍手術(shù)期監(jiān)護(hù)治療水平的進(jìn)步，CPB手術(shù)的安全性大大提高，但是CPB帶來的非生理性的血流灌注仍可誘發(fā)全身性炎癥反應(yīng)綜合癥(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，導(dǎo)致術(shù)后各臟器

2、系統(tǒng)不同程度的損傷。急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是SIRS的早中期改變，癥狀輕的患者僅為亞臨床表現(xiàn)，而重癥患者則表現(xiàn)為ALI，甚至是急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。ALI/ARDS會顯著延長病人術(shù)后呼吸機(jī)應(yīng)用時(shí)間、ICU滯留時(shí)間等，不但增加了家庭及社會負(fù)擔(dān)，而且增加患者的死亡率，嚴(yán)重影響預(yù)后。因此，研究CPB對肺的損傷機(jī)制以及探索行之有效

3、的肺保護(hù)方法，對CPB手術(shù)患者術(shù)后肺功能的恢復(fù)及遠(yuǎn)期生存至關(guān)重要。
　　α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，僅1-AT）是一種具有蛋白酶抑制作用的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，分子量為5.2kDa，是血漿中主要的蛋白酶抑制物，能抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶、血漿素等蛋白酶的活性，可以保護(hù)機(jī)體內(nèi)的正常組織避免蛋白酶的損傷。最近的研究表明α1-AT可抑制炎癥反應(yīng)過程中的多個(gè)環(huán)節(jié)，抑制炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的過度釋放，減少PM

4、N的激活，清除超氧陰離子、自由基等活性氧，維持氧化/抗氧化物的動(dòng)態(tài)平衡，避免過度應(yīng)激對機(jī)體自身的損傷，繼而具有防治肺損傷的功效。本研究從炎癥因子的釋放、細(xì)胞凋亡、氧化-抗氧化角度探討α1-AT對CPB術(shù)后肺功能的保護(hù)作用。
　　第一部分 血漿晚期氧化蛋白產(chǎn)物濃度與急性肺損傷的相關(guān)性研究
　　目的:
　　急性肺損傷(ALI)是體外循環(huán)(CPB)心臟手術(shù)后常見的并發(fā)癥。本研究擬觀察CPB心臟直視手術(shù)圍術(shù)期內(nèi)血漿晚期氧化蛋白

5、產(chǎn)物(AOPPs)的水平變化，明確氧化應(yīng)激與CPB術(shù)后ALI的相關(guān)性，以及AOPPs預(yù)測CPB術(shù)后ALI的有效性。
　　方法:
　　本研究為前瞻性研究，經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院倫理委員會同意批準(zhǔn)，將2014年1月1日至5月31日南方醫(yī)院胸心外科在CPB下行心臟手術(shù)的患者納入本研究。參考1994年歐美聯(lián)系會議制定的ALI診斷標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)患者CPB手術(shù)后是否發(fā)生ALI，將患者分為ALI組和非ALI組。在術(shù)前、術(shù)后1小時(shí)、術(shù)后12小時(shí)

6、、術(shù)后24小時(shí)和術(shù)后48小時(shí)獲得患者全血2ml。采用ELISA方法檢測血漿中AOPPs的濃度。研究所涉及的計(jì)量數(shù)據(jù)，均先通過one-sampleKolmogorov-smimov檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。Student's t檢驗(yàn)或Mann-WhitneyU檢驗(yàn)檢測兩組之間各指標(biāo)的差異。應(yīng)用多因素逐步Logistic(stepwiselogistic)回歸模型分析AOPPs與ALI發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，以受試者工作特征曲線(ROC)及曲線下面積

7、(AUC)評價(jià)這個(gè)生物學(xué)指標(biāo)的回歸模型對ALI的診斷價(jià)值。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS22.0軟件進(jìn)行分析，P＜0.05為有顯著性差異。
　　結(jié)果:
　　在本研究期間共有70例符合本研究納入標(biāo)準(zhǔn)的、在CPB下行心臟手術(shù)的成人患者，其中18人(25.7％)發(fā)生ALI。ALI組患者慢性阻塞性肺病、高血壓的患病率高于非ALI組。ALI組患者住院時(shí)間和重癥監(jiān)護(hù)時(shí)間較非ALI組患者明顯延長。CPB結(jié)束后，所有患者血漿中AOPPs的濃度較

8、術(shù)前明顯升高，并且在術(shù)后1小時(shí)開始升高，術(shù)后12小時(shí)開始下降。ALI組患者CPB術(shù)后1小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)AOPPs濃度明顯高于非ALI組患者。非ALI組患者血漿AOPPs濃度在術(shù)后24小時(shí)降至基線水平，ALI組患者血漿AOPPs濃度在術(shù)后1小時(shí)達(dá)到峰值，術(shù)后12小時(shí)快速下降，在術(shù)后24小時(shí)再次升高。
　　結(jié)論:
　　本研究表明，CPB術(shù)后血漿中AOPPs的濃度明顯升高，其升高水平與肺損傷程度明顯相關(guān)。血漿中A

9、OPPs是CPB術(shù)ALI早期可靠的預(yù)測指標(biāo)。AOPPs在CPB術(shù)后肺損傷的臨床表現(xiàn)和病情進(jìn)展中的作用還需要進(jìn)一步的研究。
　　第二部分 α1-抗胰蛋白酶對體外循環(huán)肺損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:
　　1、應(yīng)用α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)對體外循環(huán)(CPB)術(shù)后急性肺損傷(ALI)比格犬進(jìn)行干預(yù)，從氧化-抗氧化角度說明其對肺臟具有保護(hù)作用。
　　2、研究α1-AT對比格犬CPB術(shù)后肺部炎癥反應(yīng)的抑制作用，并探

10、討其抑制炎癥的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1、急性肺損傷模型的建立。選取成年健康比格犬30只(14.5±0.63)kg，隨機(jī)分為3組，Ⅰ組（空白對照組），Ⅱ組（CBP術(shù)后ALI組），Ⅲ組(CPB術(shù)后ALI+α1-AT干預(yù)組)。采用2％戊巴比妥鈉靜脈麻醉（劑量30mg/kg），CPB手術(shù)過程中用微量泵持續(xù)泵入維持麻醉效果（劑量10 mg/kg/h）。
　　2、給藥方法及監(jiān)測指標(biāo)。Ⅲ組在預(yù)充液中加入50 mg/kg劑量的α

11、1-AT。分別記錄各組動(dòng)物T1:CPB手術(shù)前，T2:CPB轉(zhuǎn)機(jī)后30分鐘，T3:CPB轉(zhuǎn)機(jī)后2小時(shí)，T4:CPB結(jié)束后6小時(shí)，T5:CPB結(jié)束后12小時(shí)的心率、血壓、氧飽和度等生命體征，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)留動(dòng)脈血標(biāo)本，用于實(shí)時(shí)監(jiān)測血?dú)夥治黾捌渌装Y指標(biāo)的檢測。
　　結(jié)果:
　　1、血?dú)夥治雠c血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測結(jié)果:CPB術(shù)后急性肺損傷組（對照組）氧合指數(shù)較空白對照組顯著降低(P＜0.001)，應(yīng)用α1-AT干預(yù)（實(shí)驗(yàn)組）可以明顯提高比

12、格犬氧合指數(shù)，改善組織氧合。PiCCO監(jiān)測結(jié)果也顯示應(yīng)用α1-AT干預(yù)可以明顯降低EVLW、PVPI等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。
　　2、與空白對照組比較，對照組、實(shí)驗(yàn)組比格犬CPB術(shù)后血漿IL-8，TNF-α，MMP-9濃度均明顯升高(P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001)。與對照組比較，使用α1-AT預(yù)處理能顯著降低這些炎癥因子與蛋白酶的水平。
　　結(jié)論:
　　1、α1-AT可有效減輕比格犬CPB術(shù)后肺損傷，改善肺

13、功能和組織氧合、降低血管外肺水指數(shù)及毛細(xì)血管通透性指數(shù)，減輕肺水腫。
　　2、α1-AT能顯著減少比格犬CPB術(shù)后肺組織中炎癥因子及蛋白酶的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。
　　3、α1-AT通過減少活性氧生成，抑制氧化應(yīng)激對肺部的損害來實(shí)現(xiàn)其保護(hù)肺功能的作用。
　　第三部分 α1-抗胰蛋白酶對人肺泡上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用
　　目的:
　　本研究以體外培養(yǎng)的人肺泡上皮細(xì)胞（HPAEpiC細(xì)胞）為研究對象，用H2

14、O2處理HPAEpiC細(xì)胞，建立細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，觀察氧化應(yīng)激下，HPAEpiC細(xì)胞的活性氧(ROS)生成、細(xì)胞存活率，F(xiàn)asL、Fas、cleaved caspase-8、caspase-3、caspase-9、以及UCP-2的表達(dá)變化，以及預(yù)先給予α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)能否減少ROS生成、下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白、提高細(xì)胞存活率。初步探討α1-AT對肺泡上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)分為空白對

15、照組、對照組（H2O2處理組）和實(shí)驗(yàn)組(H2O2處理與α1-AT(2mg/ml)干預(yù)組），以濃度為500μmol/L的H2O2處理HPAEpiC細(xì)胞24 h。采用激光共聚焦顯微鏡檢測HPAEpiC細(xì)胞線粒體ROS產(chǎn)生，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，采用AnnexinⅤ/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blotting)測定FasL、Fas、cleaved caspase-8、caspase-3、ca

16、spase-9、以及UCP-2的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1、與空白對照組比較，對照組的HPAEpiC細(xì)胞在H。O。的作用下凋亡率明顯升高(P＜0.05)，同時(shí)FasL、Fas、以及cleaved caspase-8表達(dá)顯著上調(diào)。實(shí)驗(yàn)組加入α1-AT后，HPAEpiC細(xì)胞凋亡率明顯下降(P＜0.05)，F(xiàn)asL、Fas以及cleavedcaspase-8表達(dá)也相應(yīng)下調(diào)。
　　2、與空白對照組比較，對照組的HPAEpi

17、C細(xì)胞caspase-3、caspase-9表達(dá)顯著上調(diào)，而UCP-2表達(dá)下降(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組加入α1-AT后，HPAEpiC細(xì)胞caspase-3、caspase-9表達(dá)也相應(yīng)下調(diào)，而UCP-2表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、氧化應(yīng)激可以激活外源性凋亡通路，上調(diào)Fas、FasL、cleaved caspase-8表達(dá)，導(dǎo)致HPAEpiC細(xì)胞凋亡。
　　2、氧化應(yīng)激可以激活內(nèi)源性凋亡通路，上調(diào)c