轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1對(duì)大鼠椎間盤細(xì)胞自噬與凋亡的影響.pdf

1、第一部分，TGF-β1是否參與椎間盤細(xì)胞自噬與凋亡的調(diào)節(jié)
　　目的:觀察退變大鼠椎間盤組織中TGF-β1表達(dá)情況，及其與椎間盤細(xì)胞自噬與凋亡的關(guān)系。
　　方法:制作大鼠腰椎動(dòng)靜力失穩(wěn)模型，HE染色檢測腰椎間盤退變程度，TUNEL染色原位檢測細(xì)胞凋亡率，免疫組化染色檢測TGF-β1表達(dá)。Western blot檢測TGF-β1、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、pro-caspase-3和cleaved caspase-3蛋白表

2、達(dá)。最后分析TGF-β1是否參與椎間盤細(xì)胞自噬與凋亡的調(diào)節(jié)。
　　結(jié)果:成功制作大鼠動(dòng)靜力失穩(wěn)椎間盤退變模型。隨著造模時(shí)間延長，HE染色顯示大鼠腰椎椎間盤退變程度逐漸加重;免疫組化也顯示手術(shù)組大鼠椎間盤內(nèi)TGF-β1表達(dá)逐漸增高，在6月時(shí)最高，12月時(shí)又逐漸下降，但三個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均高于假手術(shù)組;TUNEL染色顯示細(xì)胞凋亡在手術(shù)組大鼠椎間盤明顯高于假手術(shù)組。Western blot顯示TGF-β1在兩組動(dòng)物模型中的表達(dá)趨勢(shì)與自噬標(biāo)記

3、蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1一致。但凋亡標(biāo)記蛋白pro-caspase-3和cleaved caspase-3的表達(dá)在手術(shù)組大鼠椎間盤內(nèi)的表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組，并隨著退變的加重逐漸增高。
　　結(jié)論:TGF-β1表達(dá)于椎間盤退變組織，并隨著退變加重逐漸增高，退變后期表達(dá)反而下降;TGF-β1可能通過調(diào)節(jié)椎間盤細(xì)胞的自噬與凋亡參與椎間盤退變的過程。
　　第二部分，TGF-β1在血清剝奪誘導(dǎo)的纖維環(huán)細(xì)胞自噬與凋亡相互作用

4、中的研究
　　目的:本研究旨在明確TGF-β1對(duì)椎間盤細(xì)胞中自噬與凋亡的作用，并為預(yù)防及治療椎間盤退變提供有效的分子生物學(xué)證據(jù)。
　　方法:大鼠纖維環(huán)細(xì)胞經(jīng)分離、培養(yǎng)、傳代后予以血清剝奪12、24、36、48小時(shí)來誘導(dǎo)自噬及凋亡。加入TGF-β1并使之在培養(yǎng)液內(nèi)的終濃度為分別為5、10及20 ng/mL。同時(shí)應(yīng)用自噬促進(jìn)劑3-MA及自噬阻斷劑BafA并觀察TGF-β1與血清剝奪誘導(dǎo)的纖維環(huán)細(xì)胞自噬與凋亡之間的關(guān)系和可能的作用

5、機(jī)制。
　　結(jié)果:10 ng/mL TGF-β1能夠顯著抑制血清剝奪48小時(shí)誘導(dǎo)的纖維環(huán)細(xì)胞過度自噬并減少凋亡。TGF-β1通過增強(qiáng)ERK1/2、p-AKT、p-mTOR的磷酸化并下調(diào)LC3Ⅱ/Ⅰ及cleaved caspase-3的表達(dá)，并能夠部分降低自噬促進(jìn)劑3-MA增強(qiáng)的自噬及凋亡水平。TGF-β1能協(xié)同自噬抑制劑Baf A進(jìn)一步抑制自噬及凋亡。3-MA能夠同時(shí)阻斷ERK、AKT和mTOR的磷酸化，部分上調(diào)由TGF-β1抑制

6、的LC3Ⅱ/Ⅰ及cleaved caspase-3水平。
　　結(jié)論:TGF-β1能夠通過下調(diào)過度的自噬從而降低血清剝奪誘導(dǎo)的纖維環(huán)細(xì)胞的凋亡，PI3K-AKT-mTOR及MAPK-ERK1/2通路是TGF-β1發(fā)揮效應(yīng)的可能機(jī)制。
　　第三部分，TGF-β1抑制外源性過氧化氫誘導(dǎo)的纖維環(huán)細(xì)胞自噬與凋亡
　　目的:本研究旨在明確TGF-β1對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的纖維環(huán)細(xì)胞自噬與凋亡的作用，并探討其可能的作用機(jī)制。
　　方

7、法:大鼠纖維環(huán)細(xì)胞經(jīng)分離及培養(yǎng)、傳代后全血清培養(yǎng)，加入不同濃度的過氧化氫（使之終濃度為分別為50、100及200μmol/L）0.5、1、2、4小時(shí)。加入TGF-β1并使之在培養(yǎng)液內(nèi)的終濃度分別為5、10及20 ng/mL）。同時(shí)應(yīng)用自噬阻斷劑BafA及多種凋亡阻斷劑來觀察TGF-β1對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的自噬與凋亡之間的關(guān)系和可能的作用機(jī)制。
　　結(jié)果:過氧化氫能明顯抑制纖維環(huán)細(xì)胞的活力并有劑量依賴及時(shí)間效應(yīng)。過氧化氫通過激活ERK促

8、進(jìn)細(xì)胞自噬與凋亡。100μmol/L過氧化氫刺激1h后自噬水平即達(dá)到峰值。過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要通過內(nèi)源性凋亡通路。TGF-β1能夠抑制過氧化氫對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞的毒性作用。TGF-β1可以抑制過氧化氫刺激1h后上調(diào)的Beclin-1及LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)，同時(shí)通過抑制Bax/Bcl-2、上調(diào)線粒體膜電位而減少細(xì)胞色素C的釋放，減少caspase-9及caspase-3的水平。TGF-β1的保護(hù)作用通過抑制ERK實(shí)現(xiàn)。TGF-β1能夠上調(diào)谷