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文檔簡介
1、禽呼腸孤病毒(avian reovirus,ARV)感染可引起雞和火雞的病毒性關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎和免疫抑制,給養(yǎng)禽業(yè)造成重大損失。己證實(shí)ARV感染能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡,且與病毒的致病作用有關(guān),但如何降低ARV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有待進(jìn)一步研究。本研究旨在探索自噬抑制劑CQ及E64d+pepstatinA對(duì)ARV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。
首先使用MTT法檢測兩種自噬抑制劑對(duì)ARV誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制的影響。結(jié)果顯示,經(jīng)兩種自噬抑制劑預(yù)處理的DF
2、1細(xì)胞感染ARV后,病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制率顯著降低。進(jìn)一步經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),兩種自噬抑制劑作用后,ARV誘導(dǎo)的DF1細(xì)胞融合病變顯著減少。最后,使用PI和Annexin V-FITC雙染法進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測,結(jié)果顯示,經(jīng)CQ或E64d+pepstatinA處理后,ARV誘導(dǎo)的DF1細(xì)胞凋亡率顯著降低。
Caspase-3的裂解水平高低通常被認(rèn)為是凋亡發(fā)生強(qiáng)弱的標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)采用westernblot法檢測ARV(GX/2010
3、/1株)感染的DF1細(xì)胞caspase-3活性,發(fā)現(xiàn)經(jīng)CQ或E64d+pepstatinA預(yù)處理后,ARV誘導(dǎo)的DF1細(xì)胞凋亡率顯著降低。進(jìn)一步進(jìn)行病毒衣殼蛋白σC表達(dá)檢測及病毒滴度測定,發(fā)現(xiàn)兩種自噬抑制劑均可顯著降低病毒復(fù)制水平。
禽呼腸孤病毒可利用凋亡使感染禽產(chǎn)生病理反應(yīng),鑒于兩種自噬抑制劑可在細(xì)胞水平抑制ARV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。使用CQ或E64d+pepstatinA對(duì)11日齡雞胚預(yù)處理后,接種ARV
4、病毒(GX/2010/1株),并設(shè)立對(duì)照組。收集尿囊液進(jìn)行病毒滴度測定,發(fā)現(xiàn)經(jīng)兩種自噬抑制劑處理后,病毒滴度顯著低于單獨(dú)接毒組。收集組織樣品進(jìn)行蛋白檢測,并統(tǒng)計(jì)雞胚死亡率,繪制生存率曲線。結(jié)果顯示,CQ或E64d+pepstatinA均可顯著抑制ARV誘導(dǎo)的雞胚法氏囊、心臟及腸組織細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步降低雞胚死亡率。
本研究證明自噬抑制劑CQ和E64d+pepstatinA在抑制自噬的基礎(chǔ)上可顯著抑制ARV(GX/2010/1株)
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