不同根際pH處理下藍莓根系轉錄組及氮、鐵代謝相關基因表達分析.pdf

1、藍莓(Blueberry)又名越橘，屬杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬（Vaccinium spp.）植物，是21世紀新興保健水果。果實富含花青素、黃酮等生物活性物質(zhì)，具有抗癌、清除自由基和延緩衰老等功能，而備受推崇。但藍莓對栽培條件苛刻，限制了其在全國范圍內(nèi)大面積種植。非酸性土壤就是影響藍莓生長發(fā)育的一大重要因素。眾所周知，藍莓適宜在土壤pH4.5-5.5之間生長，超過酸性范圍易造成藍莓生長停滯，葉片黃化等現(xiàn)象。雖然前人對藍莓不適

2、宜非酸性土壤做了大量研究，但都只停留在營養(yǎng)生理學方面，而從分子生物學角度出發(fā)探究其分子機理仍鮮見報道。
　　本論文主要包含4個方面的研究內(nèi)容。首先以‘夏普藍’（Sharpblue）等5個浙江省主栽藍莓品種為材料，設置不同pH根際土壤處理，通過生理生化指標分析篩選非酸性土壤適應性最強的藍莓品種;其次，利用RNA-Seq技術對藍莓在不同pH處理下的根系進行轉錄組測序，獲得大量轉錄本序列;接著，分別構建3個表達譜文庫（即pH5.0、pH

3、7.0-3d和pH7.0-6d文庫），篩選差異表達基因(DEGs)，建立數(shù)字基因表達譜;最后，探究了pH和不同氮源形態(tài)相互作用對藍莓生理和氮、鐵代謝相關基因表達水平的影響。
　　本研究主要結果如下:
　　1、‘夏普藍’（Sharpblue）、‘奧尼爾’(O'Neal)、‘Star’、‘布里吉塔’(Brigitta)和‘早藍’(Earliblue)分劇都在pH5.0、pH7.0和pH7.5根際土壤中處理6個月。研究發(fā)現(xiàn)在pH7

4、.0和7.5根際土壤脅迫下，5個藍莓品種的葉片失綠黃化，根系減少發(fā)黑，F(xiàn)v/Fm、葉綠素含量和根系活力均有不同程度地下降，而根系和葉片的鐵螯合還原酶(FCR)活性大體上都呈適應性上升趨勢。根據(jù)上述結果表明北高叢藍莓（早藍和布里吉塔）對中堿性土壤的敏感程度大于南高叢藍莓(夏普藍、奧尼爾和Star)，其中適應性最好和最差的藍莓品種分別是奧尼爾和早藍。
　　2、藍莓根系進行轉錄組測序后，共獲得110，098，570個Clean read

5、s，對其進行de nove轉錄組組裝和拼接后，最終得到287，800條Mixed-Unigene，平均序列長度是526 bp，N50值為997nt。將獲得的Mixed-Unigene序列與幾個已知的公共數(shù)據(jù)庫進行比對，結果發(fā)現(xiàn)被NR(NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫)、NT(NCBI非冗余核酸數(shù)據(jù)庫)和Swiss-Prot（去冗余蛋白數(shù)據(jù)庫）分別注釋上的序列有127，216、77，897和81，531條。在COG（蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫）功能分

6、類中，有59,776條序列被分成了25個類別。KEGG（代謝途徑數(shù)據(jù)庫）分析表明，有79，995條Mixed-Unigene序列共參與了129條代謝途徑。根據(jù)NR注釋信息，共有86，806條序列被GO(基因功能分類數(shù)據(jù)庫)的生物學過程（Biological process）、細胞組分(Cellular component)和分子功能(Molecular function)這3個本體進行分類。通過與公共蛋白數(shù)據(jù)庫比對，得到129，972個

7、編碼蛋白框(CDS)，其氨基酸序列長度大多小于500 nt。簡單重復序列(SSR)和單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析發(fā)現(xiàn)，SSR中雙堿基重復個數(shù)最多，達到18，938個;SNP中轉換變異大約占2/3。
　　3、通過對pH5.0、pH7.0-3d和pH7.0-6d表達譜文庫進行兩兩差異表達基因分析，結果發(fā)現(xiàn)pH7.0-3d與酸性對照(pH5.0)相比共得到7，336個差異表達基因(DEGs)，其中顯著下調(diào)的有4，669個，上調(diào)的DEGs

8、有2，667個;在pH5.0與pH7.0-6d間，有7，973個DEGs，其中3，650個上調(diào)，4，323個下調(diào)。KEGG功能分析表明，pH5.0-Vs-pH7.0-3d、pH5.0-Vs-pH7.0-6d和pH7.0-3d-Vs-pH7.0-6d中分別有1，836、2，182和1，054個DEGs被顯著富集到6、7和8條代謝途徑中。在轉錄組文庫中篩選到超過24種不同家族的轉錄因子，其中DEGs主要涉及ERF、NAC、WRKY、bHLH

9、和MYB等轉錄因子家族。等級聚類分析三處理間的表達模式，發(fā)現(xiàn)486個DEGs被分成6種模式，其中最多的是上調(diào)-上調(diào)-下調(diào)表達模式。隨機選取6條Unigene用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術對RNA-Seq差異表達基因的表達趨勢進行驗證，結果表明RPKM法和qRT-PCR法測定的DEGs表達趨勢相似，兩者相關系數(shù)R值達到0.8210，呈極顯著水平。
　　4、藍莓分別水培于pH5.0-NH4+、pH5.0-NO3、pH7.5

10、-NH4+和pH7.5-NO3介質(zhì)中處理15d。結果顯示，在pH7.5-NH4+和pH7.5-NO3-處理下藍莓根系發(fā)黑，F(xiàn)v/Fm下降。葉綠素含量、根系活力和全氮含量在pH5.0-NH4+處理下最高，其次是pH5.0-NO3，最差的是在pH7.5-NH4+處理中。與銨態(tài)氮源處理相比，以硝態(tài)氮為氮源的植株其硝酸含量上升，并與pH相關性不大。與酸性處理相比，堿性處理下顯著增加FCR活性，與不同氮源形態(tài)相關性較小。
　　5、利用qRT

11、-PCR分析藍莓根系氮、鐵代謝相關基因的表達變化，結果發(fā)現(xiàn)與pH5.0-NH4+相比，轉錄因子（FER）和鐵蛋白基因(Fer2)在其它3個處理下表達相對下降，而鐵螫合還原酶（FR O2）、天然抗性相關巨噬細胞蛋白3（Nramp3）和H+-ATPsae酶（HA）基因表達都上調(diào)。銨轉運蛋白基因(AMTs)在有銨態(tài)氮源下顯著上調(diào)表達;以硝態(tài)氮為唯一氮源時，硝酸轉運蛋白（NRT1.5和NR T2）、硝酸還原酶(NR)和亞硝酸還原酶基因(NiR)