缺鐵黃化對(duì)‘碭山酥梨’葉片光合特性、氮代謝相關(guān)酶活性及基因表達(dá)的影響.pdf

1、鐵是梨樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育所必需的16種營(yíng)養(yǎng)元素之一，在梨樹(shù)蛋白質(zhì)和核酸的合成、光合作用、呼吸作用等諸多生理代謝過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用。在中性和堿性條件下，鐵有效性低，容易發(fā)生Fe(OH)3沉淀。在高pH值條件下，每增加1個(gè)pH單位，溶液中活性鐵就減少1000倍，黃河故道地區(qū)是我國(guó)梨主產(chǎn)區(qū)之一，土壤pH值在7.5~8.0之間，缺鐵現(xiàn)象嚴(yán)重。
　　前期研究表明，鐵缺乏時(shí)，還影響其他礦質(zhì)元素的吸收，‘碭山酥梨’黃化葉片中不僅鐵含量明顯下降，

2、其氮含量也明顯下降，且存在明顯的相關(guān)性。鐵又是氮代謝過(guò)程中很多酶的活化劑，如硝酸還原酶（NR）、亞硝酸還原酶（NiR）等，因此，研究鐵脅迫條件下，礦質(zhì)元素之間的互作有一定的理論價(jià)值。
　　氮代謝是果樹(shù)的基本生理過(guò)程之一。氮素同化的主要途徑是經(jīng)過(guò)硝酸鹽還原為銨后直接參與氨基酸的合成與轉(zhuǎn)化，期間硝酸還原酶（NR）、亞硝酸還原酶（NiR）、谷氨酸合酶（GOGAT）與谷氨酰胺合成酶（GS）等關(guān)鍵酶參與了催化和調(diào)節(jié)。以氨基酸為主要底物在細(xì)胞

3、中合成蛋白質(zhì)，再經(jīng)過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)的修飾、分類、轉(zhuǎn)運(yùn)及儲(chǔ)存等，成為果樹(shù)有機(jī)體的組成部分。
　　目前有關(guān)果樹(shù)缺鐵對(duì)其相關(guān)基因與蛋白活性的影響研究較多，有關(guān)缺鐵對(duì)氮元素含量、氮代謝及其相關(guān)基因與蛋白活性的影響國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道。為了探討缺鐵對(duì)‘碭山酥梨’葉片光合速率、葉綠素?zé)晒馓匦浴代謝相關(guān)酶活性及相關(guān)基因表達(dá)的影響，試驗(yàn)以不同黃化程度的葉片為試材，測(cè)定黃化葉片中Fe、N的含量、葉片光合速率、葉綠素?zé)晒馓匦约癋e、N代謝相關(guān)酶的活性，分析了

4、缺鐵對(duì)N元素含量的影響及其之間的相關(guān)性；同時(shí)克隆了葉片中三價(jià)鐵螯合物還原酶基因（FRO）、硝酸還原酶基因（NR）、亞硝酸還原酶基因（NiR）、谷氨酸合酶基因（GOGAT）與谷氨酰胺合成酶基因（GS），并通過(guò)Real-time PCR技術(shù)分析其在不同黃化程度葉片中的相對(duì)表達(dá)量。主要結(jié)果如下：
　　1、不同程度黃化葉片中Fe含量的變化與N的含量呈極顯著正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為r（Fe，N）=0.934。說(shuō)明缺鐵的同時(shí)，也引起了N元素的缺乏

5、。
　　2、‘碭山酥梨’黃化葉片凈光合速率降低，胞間CO2濃度升高，光合速率下降為非氣孔限制；黃化對(duì)葉片光系統(tǒng)的影響，首先表現(xiàn)為放氧復(fù)合體（OEC）結(jié)構(gòu)的破壞，進(jìn)而導(dǎo)致葉片的PSII反應(yīng)中心受到不同程度的傷害，造成電子傳遞鏈?zhǔn)茏?，降低葉片的光能利用效率。
　　3、‘碭山酥梨’黃化葉片中FCR活性均顯著低于對(duì)照。隨黃化程度的增加， FCR活性呈逐漸上升的趨勢(shì)，且達(dá)到極顯著差異。黃化葉片中NR、NiR活性均顯著低于對(duì)照，隨黃化程

6、度的增加，黃化葉片中NR、NiR活性均呈逐漸上升的趨勢(shì)，且達(dá)到極顯著差異。輕度黃化葉片的GOGAT活性顯著高于對(duì)照，而隨黃化程度的增加，GOGAT活性呈下降的趨勢(shì)，中度黃化、重度黃化葉片谷氨酸合酶與對(duì)照相比差異不顯著；輕度黃化、中度黃化葉片的GS活性與對(duì)照相比差異不顯著，重度黃化葉片的GS活性顯著低于對(duì)照。
　　4、通過(guò)查找GenBank并比對(duì)梨基因組數(shù)據(jù)庫(kù)得到FCR、NR、NiR、GAGAT和GS的同原序列，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)

7、證并獲得了FCR、NR、NiR、GAGAT和GS序列。生物信息學(xué)分析表明，F(xiàn)CR基因序列編碼區(qū)（CDS）為2166 bp，編碼721個(gè)氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)可能位于質(zhì)膜，屬于疏水蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)含有45.91％的α-螺旋；NR基因序列編碼區(qū)（CDS）為2709 bp，編碼902個(gè)氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)可能位于細(xì)胞質(zhì)，屬于疏水蛋白二，級(jí)結(jié)構(gòu)含有29.05%的α-螺旋；NiR基因序列編碼區(qū)（CDS）為1758 bp，編碼585個(gè)氨基酸，編碼的蛋白

8、質(zhì)可能位于細(xì)胞核，屬于疏水蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)含有37.44%的α-螺旋；GOGAT基因序列編碼區(qū)（CDS）為4887 bp，編碼1628個(gè)氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)可能位于細(xì)胞質(zhì)，屬于親水蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)含有39.31%的α-螺旋；GS基因序列編碼區(qū)（CDS）為1071 bp，編碼356個(gè)氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)可能位于微體，屬于親水蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)含有28.37%的α-螺旋。
　　5、FCR、NR、NiR、GOGAT和GS活性與其基因的表達(dá)量的變