惡疫霉PcF-SCR效應(yīng)分子編碼基因的轉(zhuǎn)錄特征、克隆和功能分析.pdf

1、由惡疫霉(Phytophthora cactorum)侵染引起的植物疫病是世界性分布的土傳毀滅性病害，危害超過200種植物，常給草莓、蘋果、梨、番茄和花卉等多種經(jīng)濟(jì)作物的生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失。近年來，我國以水果、蔬菜、花卉等為主的設(shè)施農(nóng)業(yè)得到快速發(fā)展，由惡疫霉引起的植物疫病對(duì)設(shè)施農(nóng)業(yè)的威脅也日趨嚴(yán)重。從疫霉菌與植物互作的角度出發(fā)深入了解疫霉菌致病的分子機(jī)理，可為新的殺菌劑作用靶標(biāo)開發(fā)和植物疫病控制策略設(shè)計(jì)提供重要指導(dǎo)。
　　基于前期惡

2、疫霉轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，本研究利用半定量RT-PCR技術(shù)首先分析了選取的32個(gè)致病相關(guān)基因在4個(gè)不同生長發(fā)育時(shí)期（菌絲、游動(dòng)孢子囊、游動(dòng)孢子和萌發(fā)休止孢）和侵染本氏煙階段（接種后1.5、3、6、12、24、48、96 h）的轉(zhuǎn)錄特征。結(jié)果顯示，13個(gè)基因在惡疫霉生長發(fā)育階段和侵染階段差異上調(diào)表達(dá)，其中包括8個(gè)PcF/SCR效應(yīng)分子編碼基因。
　　通過高保真擴(kuò)增技術(shù)將這13個(gè)效應(yīng)分子編碼基因克隆到馬鈴薯X病毒(Potato virus

3、X,PVX)表達(dá)載體pGR107中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因瞬時(shí)表達(dá)法分析這些效應(yīng)分子是否能夠引起植物細(xì)胞死亡(Plant cell death，PCD)。結(jié)果表明，4個(gè)PcF/SCR效應(yīng)分子U866、U14169、U16448和U18031能夠在番茄上引起PCD，并且U866和U16448也能夠觸發(fā)本氏煙的PCD。另外激發(fā)素(elicitin)效應(yīng)分子U7626和NLP效應(yīng)分子U2101能夠觸發(fā)本氏煙的PCD，其中U7626也能夠在三生煙

4、上引起PCD。
　　為進(jìn)一步明確PcF/SCR效應(yīng)分子在惡疫霉致病過程中的作用，本研究首先建立了CaCl2-Polyethylene glycol(PEG)介導(dǎo)的惡疫霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法以進(jìn)行基因沉默分析。首先確定了惡疫霉對(duì)遺傳霉素G418的抗性篩選濃度，然后通過轉(zhuǎn)入外源的綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因?qū)D(zhuǎn)化方法進(jìn)行驗(yàn)證，通過在熒光顯微鏡下對(duì)轉(zhuǎn)化子及轉(zhuǎn)化子單孢純化株的菌絲進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)

5、均發(fā)出綠色熒光，表明惡疫霉穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系的成功建立。然后，利用建立的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法對(duì)PcF/SCR效應(yīng)分子U866在惡疫霉中進(jìn)行了基因穩(wěn)定沉默。結(jié)果顯示，與對(duì)照菌株相比，基因沉默轉(zhuǎn)化子對(duì)本氏煙的致病力顯著下降，對(duì)外源活性氧的敏感性顯著增強(qiáng)，表明該效應(yīng)分子在惡疫霉與寄主植物的互作過程中發(fā)揮著重要作用。
　　本研究篩選獲得了8個(gè)惡疫霉PcF/SCR效應(yīng)分子，明確了這些基因在惡疫霉生長發(fā)育和侵染階段差異上調(diào)表達(dá)的特征;克隆了基因全長序列;利