大豆疫霉群體遺傳結(jié)構(gòu)及致病相關(guān)基因的篩選和功能分析.pdf

1、大豆疫霉Phytophthorae 是一種極為重要的植物病原菌，由其引起的大豆根腐病是大豆生產(chǎn)上的毀滅性病害之一。 目前，利用大豆抗性是控制大豆疫霉根腐病最為經(jīng)濟(jì)有效的措施，但是，在實(shí)踐中往往會(huì)出現(xiàn)新的毒性群體重新發(fā)展為優(yōu)勢(shì)群體而造成抗病品種失去作用的現(xiàn)象。研究大豆疫霉的群體遺傳結(jié)構(gòu)特征和致病性變化的分子機(jī)制，有助于揭示大豆疫霉的群體遺傳結(jié)構(gòu)變化的分子機(jī)理，從而有利于病害的控制。 就大豆疫霉的土壤誘捕方法進(jìn)行了改進(jìn)。改進(jìn)措施主

2、要是使用青霉素、利福平、五氯硝基苯和多菌靈等藥劑(使用終濃度分別為50、20、25和25 mg／L)控制誘捕大豆疫霉過(guò)程中的雜菌污染。采用改良的誘捕方法，從含有100個(gè)卵孢子的10 g土樣中誘捕到大豆疫霉菌的幾率為100％。應(yīng)用改良方法對(duì)采自中國(guó)黑龍江大豆田的土樣和美國(guó)、巴西等進(jìn)口大豆夾帶的土樣進(jìn)行了大豆疫霉誘捕，結(jié)果顯示，黑龍江土樣的大豆疫霉的分離率為53％，而進(jìn)口大豆夾帶土樣的大豆疫霉分離率為75％。 用SSR和RAPD兩種

3、分子標(biāo)記對(duì)來(lái)自中國(guó)和美國(guó)的111個(gè)大豆疫霉菌株進(jìn)行了DNA指紋分析。結(jié)果顯示，20對(duì)SSR引物共擴(kuò)增出113條條帶，其中多態(tài)性條帶比例為100％，而21條RAPD引物共擴(kuò)增出223條條帶，多態(tài)性條帶比例為89％。SSR和RAPD分析都表明：在88％的相似性水平上可將111個(gè)菌株劃分為7個(gè)遺傳聚類組，且美國(guó)群體分布于更多的聚類組，顯示更高的遺傳變異度；中國(guó)福建的大豆疫霉群體與美國(guó)的大豆疫霉群體的遺傳相似性最高，而福建群體與黑龍江群體的遺傳

4、相似性最低：此外，結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，福建和黑龍江兩群體的遺傳多樣性低于美國(guó)群體的遺傳多樣性。綜合分析，美國(guó)的大豆疫霉不可能起源于中國(guó)黑龍江或福建；福建的大豆疫霉來(lái)自黑龍江的可能性較小，而來(lái)自美國(guó)的可能性更大；而黑龍江的部分大豆疫霉群體可能起源于美國(guó)，或者與美國(guó)大豆疫霉都起源于同一個(gè)起源中心。 采用在大豆植株上繼代式連續(xù)接種大豆疫霉的方法研究了大豆疫霉與其寄主互作過(guò)程中毒力變化的現(xiàn)象。結(jié)果表明，大豆疫霉的毒力具有一定的可變性，但不同菌株

5、毒力變異的能力存在差別；經(jīng)過(guò)14代次的連續(xù)接種，得到了比出發(fā)菌株P(guān)S2的毒性明顯增強(qiáng)的菌株P(guān)S2-vir。PS2-vir在卵孢子產(chǎn)量上明顯低于PS2；毒力結(jié)構(gòu)測(cè)定顯示，PS2-vir與PS2的毒力公式都為1b,1d,2,3a,3b,4,5,6,7；RAPD分析表明，PS2-vir與PS2在DNA指紋上沒(méi)有檢測(cè)到差異。 以大豆疫霉菌株P(guān)S2-vir和PS2為材料，通過(guò)抑制性差減雜交的方法得到了74個(gè)可能在PS2和PS2-vir間差

6、異表達(dá)的unigene，這些基因涉及蛋白質(zhì)合成、能量代謝、信號(hào)傳導(dǎo)及抗逆反應(yīng)等途徑。進(jìn)一步對(duì)在毒性文庫(kù)中出現(xiàn)頻率較高的15個(gè)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)有7個(gè)基因分布于P.sojae EST數(shù)據(jù)庫(kù)的侵染文庫(kù)中；對(duì)10個(gè)感興趣的基因進(jìn)行RT-PCR分析表明，有4個(gè)基因在毒性菌株P(guān)S2-vir中特異表達(dá)；virtual Northern分析也表明了相似的結(jié)果。對(duì)一個(gè)可能編碼腈水解酶的大豆疫霉基因PsNIA進(jìn)行了致病相關(guān)功能研究。結(jié)果表明，其

7、氨基酸序列與綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa的腈水解酶的序列有60％的同源性，且具有腈水解酶的保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，該基因在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中與高等真菌相距較遠(yuǎn)。Southern雜交結(jié)果顯示，PsNIA在大豆疫霉基因組中只有1個(gè)拷貝。對(duì)PsNIA進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄基因沉默分析，結(jié)果顯示，在所獲得的14個(gè)轉(zhuǎn)化子中，有一個(gè)轉(zhuǎn)化子致病性嚴(yán)重喪失；RT-PCR分析表明，在該轉(zhuǎn)化子中檢測(cè)不到PsNIA的mRNA的積累。說(shuō)明PsNIA