雜色鮑維甲酸X受體轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)的構(gòu)建與配體篩選.pdf

1、維甲酸X受體是核受體超家族的一員，作為配體依賴型轉(zhuǎn)錄因子在生物個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、新陳代謝和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。新近的研究表明，有機(jī)錫化合物（如TBT、TPT）導(dǎo)致的腹足類性畸變與RXR密切相關(guān)。論文以課題組前期研究克隆的雜色鮑RXR基因序列為基礎(chǔ)，構(gòu)建了雜色鮑RXR轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)，篩選了雜色鮑RXR天然配體和環(huán)境配體，并比較了這些化合物對(duì)雜色鮑和斑馬魚RXR轉(zhuǎn)錄活性影響的差異。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴克隆了雜色鮑RXR的編

2、碼區(qū)并重組至超表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，構(gòu)建了重組超表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-HdRXR。同時(shí)在報(bào)告基因pGL3-promoter啟動(dòng)子區(qū)重組維甲酸X反應(yīng)元件（RXRE），構(gòu)建了重組報(bào)告基因載體 pGL3-promoter-RXRE。應(yīng)用質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組表達(dá)載體 pcDNA3.1(+)-HdRXR和重組報(bào)告基因載體 pGL3-promoter-RXRE共轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞，構(gòu)建了雜色鮑RXR轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)。⑵采用上述構(gòu)建

3、的雜色鮑RXR轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)，對(duì)雜色鮑RXR的天然配體和環(huán)境配體進(jìn)行了篩選。結(jié)果顯示，9cRA、TBT和TPT分別在濃度為1×10-7 M、1×10-8 M和1×10-7 M時(shí)極顯著誘導(dǎo)Luc的表達(dá)，在1×10-6 M、1×10-7 M和1×10-6 M達(dá)到最大值，誘導(dǎo)倍數(shù)分別是2.25倍、2.67倍和3.23倍。1×10-8 M的 DHA顯著誘導(dǎo)Luc的表達(dá)，誘導(dǎo)倍數(shù)為1.51倍。這些結(jié)果表明TBT和TPT為雜色鮑RXR的環(huán)境配體，9c

4、RA和DHA則有可能為雜色鮑RXR的天然配體。⑶構(gòu)建了斑馬魚 RXR的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)，并比較了上述化學(xué)物質(zhì)對(duì)這兩種 RXR轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果表明，9cRA對(duì)斑馬魚RXR的有效濃度是雜色鮑的10倍，TBT是雜色鮑的100倍。TPT對(duì)斑馬魚RXR的的有效誘導(dǎo)濃度與雜色鮑相同，但對(duì)斑馬魚RXR轉(zhuǎn)錄活性的誘導(dǎo)倍數(shù)顯著低于雜色鮑。DHA對(duì)斑馬魚RXR的轉(zhuǎn)錄沒(méi)有顯著影響。這些結(jié)果表明上述化合物與RXR的結(jié)合具有物種特異性。⑷在構(gòu)建RXR轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)