日本沼蝦不同亞型維甲酸類X受體(RXR)cDNA克隆及組織表達分析.pdf

1、維甲酸類X受體(RXR)屬于核受體家族中第二亞族成員，在類固醇核受體家族中高度保守，首次是從人肝和腎細胞中的cDNA文庫中，分離到了人類的hRXR。在昆蟲和甲殼動物中，RXR處于蛻皮、變態(tài)及繁殖等生命過程的級聯(lián)反應啟動位置，對完成其生長發(fā)育和繁殖具有十分重要的作用。日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)是我國主要的淡水養(yǎng)殖蝦類品種之一，有著很高的經(jīng)濟價值。本實驗選取日本沼蝦作為研究對象，分離和克隆了RXR的五種不同

2、異構(gòu)型基因，同時通過普通PCR法初步了解了MnRXR在胚胎發(fā)育不同發(fā)育期和不同組織的表達分布。
　　 1.參照小鼠、斑馬魚、蟹、水蚤等其他物種的RXR基因具有較高保守性的核苷酸序列設計一對簡并引物，以日本沼蝦卵巢cDNA為模板，通過簡并RT-PCR的方法，獲得一條約200bp的條帶，測序后確定得到的部分cDNA序列是日本沼蝦的RXR基因。以上述所得序列設計一對特異引物進行普通RT-PCR，以管家基因beta-actin作為陽性對

3、照，研究MnRXR在精巢、卵巢、心臟、肌肉、肝胰腺、胃、鰓、表皮、腸等組織中的表達情況。結(jié)果表明其在所有組織中均有表達，在精巢、卵巢和外表皮中表達量較高。同時，又用該對特異引物對日本沼蝦在胚胎發(fā)育不同時期MnRXR的表達分布做了分析，結(jié)果顯示，MnRXR在胚胎發(fā)育各個時期均有表達，且在后無節(jié)幼體期和前蚤狀幼體期表達量達到最高。
　　 2.根據(jù)獲得的MnRXR部分序列分別設計特異引物進行5’RACE和3’RACE擴增，結(jié)果都分別得

4、到了3種不同的序列，將測得的序列分別與保守區(qū)序列進行序列拼接，最終確定了5種不同的異構(gòu)體形式，比較發(fā)現(xiàn)它們有著高度的同源性，在DBD高度保守區(qū)域都是一致的，主要是在N末端和C末端有所差異。為確保結(jié)果的準確性，分別在3’ UTR和5’UTR區(qū)域設計特異引物，進行擴增并克隆測序，證實了得到的所有序列都是完整的一個分子。經(jīng)核苷酸序列分析，其中開放閱讀框最長的MnRXR12，全長為1698bp，編碼序列為1011bp，編碼337個氨基酸，(包括

5、polyA)，5’非編碼區(qū)(5’UTR)核苷酸序列長度為354bp，3’非編碼區(qū)(3’UTR)333bp，對MnRXR12所編碼的氨基酸分析表明：其含有RXR核受體家族蛋白所具有的A-F區(qū)域的所有結(jié)構(gòu)，并且與C、D、E區(qū)域和黑背陸地蟹的GlRXRa蛋白有著100％的一致性，進一步說明克隆的MnRXR確實是日本沼蝦的RXR基因，且其氨基酸序列高度保守。從N端到C端，可以在MnRXR12的DBD區(qū)找到高度保守的P-box(EGCKG)和D-

6、box(CREER)兩個特殊結(jié)構(gòu)，同時，在鉸鏈域D域也找到了1個識別DNA的T-box，在E/F區(qū)域也有1個β-轉(zhuǎn)角區(qū)域和幾個a-螺旋(H1-H9)。然而，通過將日本沼蝦RXRa基因氨基酸序列與其它物種的多重比較發(fā)現(xiàn)，所克隆的日本沼蝦MnRXR12在H9螺旋處發(fā)生了中斷，缺失了H9-H12的功能區(qū)域，推測日本沼蝦RXR還可能存在其他異構(gòu)體形式。
　　 MnRXR13核苷酸序列全長為1659bp，編碼326個氨基酸，5’UTR核苷

7、酸序列長度為348bp，3’UTR為333bp；MnRXRs1核苷酸序列全長為1193bp，編碼277個氨基酸，5’UTR為核苷酸序列長度為99bp，3’UTR為263bp；MnRXRs2核苷酸序列全長為1346bp，編碼243個氨基酸，5’UTR為核苷酸序列長度為354bp，3’UTR為263bp；MnRXRs3核苷酸序列全長為1292bp，編碼227個氨基酸，5’UTR為核苷酸序列長度為348bp，3’UTR為263bp。對比5個不

8、同構(gòu)型的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)日本沼蝦卵巢RXR的cDNA共有四個不同的剪切位點，一個發(fā)生在5’端A/B區(qū)，產(chǎn)生了3種不同形式的5’端序列；一個在RXR受體結(jié)構(gòu)的D區(qū)即鉸鏈區(qū)域，使T-盒區(qū)長度也有3種形式(+12/+7/+7△5)，兩個發(fā)生在LBD區(qū)，其中一個是在H1-H3螺旋區(qū)域，產(chǎn)生了2種不同形式(MnRXRl/MnRXRs)，另外一個是在D區(qū)產(chǎn)生了中斷，缺失了E/F區(qū)域(MnRXRm)。
　　 3.根據(jù)得到的5個亞型的全全長序列

9、，設計特異引物進行普通RT-PCR，研究了各亞型在不同組織及胚胎發(fā)育不同時期MnRXR的表達分布情況，結(jié)果顯示，在卵巢組織中及胚胎發(fā)育早期卵裂期所有的亞型均有表達，且MnRXRs3只在卵巢中特異表達；在其他組織中，各亞型的表達分布不盡相同，揭示了不同亞型可能參與了不同的生理功能。
　　 盡管RXR在脊椎動物中有廣泛深入的研究，在甲殼動物中也有相關(guān)的數(shù)據(jù)，但是在甲殼類中，只有在陸地蟹G.lateralis中有眾多的RXR異構(gòu)體形式