胎盤HLAⅠ類分子表達格局與母胎免疫耐受作用的研究初探.pdf

1、該課題從以下四方面對"胎盤HLA-G、C和E的分布格局在母胎免疫耐受中的作用"進行初步探究.第一部分正常和難免流產(chǎn)婦女早孕蛻膜免疫效應細胞分布格局采集20例正常早孕和8例難免流產(chǎn)婦女的蛻膜和絨膜組織,檢測了生理和病理情況下蛻膜組織中NK、NKT、Mφ、T細胞各亞型和IFN-γ(Th1型)和IL-4(Th2型)細胞因子的產(chǎn)生細胞的分布頻率;以及絨膜和蛻膜組織細胞凋亡和增殖的狀態(tài).此次實驗采用CD3<'+>設門,主要檢測了產(chǎn)生IFN-γ和I

2、L-4的來源于CD3<'+>的T細胞和NKT細胞群體的數(shù)量,從細胞因子生成時間較早及CD56-CD3<'+>T細胞數(shù)目在兩組變化不大,而CD56<'->CD3<'+>NKT細胞變化顯著來看,在懷孕早期,產(chǎn)生IFN-γ和IL-4的CD3<'+>細胞主要是NKT細胞.結果顯示,在正常人早孕成熟NKT細胞(IFN-γ生成細胞)占絕對優(yōu)勢,而在難免流產(chǎn)早孕組,以不成熟NKT細胞(IL-4生成細胞)占主導.此外,正常妊娠的絨毛和蛻膜組織中都存在細

3、胞凋亡,滋養(yǎng)層細胞大量凋亡與自然流產(chǎn)有著密切的關系.絨毛細胞周期實驗也同樣表明自然流產(chǎn)組S/G2增殖期細胞數(shù)目少于正常組(P<0.05),提示正常早孕婦女的絨膜表現(xiàn)出增殖活性高于難免流產(chǎn)絨毛.第二部分正常和難免流產(chǎn)婦女KIR基因型和NK細胞同種反應性分析滋養(yǎng)層細胞表面父系HLA-C的存在,以及不同婦女蛻膜NK細胞受體的異質(zhì)性,使得"NK細胞同種反應性"在母胎界面的作用不容忽視.在正常組,KIR單倍型A占優(yōu)勢,對妊娠有利,而以多種活化性K

4、IR基因組合為特征的單倍型B在難免流產(chǎn)組占優(yōu)勢,不利于妊娠.第三部分HLA-C和HLA-G雙表達載體的克隆及在LcL721.221細胞的表達為模擬母胎界面HLAⅠ類抗原的分布格局,以及探討這種格局在母胎免疫耐受中的作用,我們用RT-PCR從孕婦絨毛膜組織有核細胞總mRNA中逆轉錄擴增全長HLA-C和HLA-G cDNA,首先將HLA-G經(jīng)BamHⅠ和C1aⅠ雙酶切,HLA-C經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后,分別定向插入真核細胞雙順反子載

5、體pVITR02的多克隆位點1(mcsl)和2(mcs2)中,然后經(jīng)酶切和測序鑒定,確定已建立pVITR02的單表達質(zhì)粒pVITR02-HLA-G和pVITR02-HLA-C,再將HLA-C cDNA經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切,定向插入單表達質(zhì)粒pVITR02-HLA-G的多克隆位點2(mcs2)中,經(jīng)PCR反應初篩,再經(jīng)限制性內(nèi)切酶和測序分析表明已成功構建了HLA-Cw*0103和HLA-G*0101的單表達質(zhì)粒pVITR02-HL

6、A-C和pVITR02-HLA-G以及雙表達質(zhì)粒pVITR02-HLA-CG.第四部分胎盤HLA-G、c和E的表達格局對子宮蛻膜效應細胞功能的影響采用正常早孕和難免流產(chǎn)婦女蛻膜未分選的全部蛻膜細胞作為效應細胞,與第三部分構建的LcL721.221-HLA-G*0101(HLA-G*0101和HLA-E共表達)細胞、LcL721.221-HLA-C*0103(HLA-C*0103和HLA-E共表達)細胞、LcL721.221-HLA-G*