角蛋白與肝臟及胰腺疾病關系的基礎與臨床研究.pdf

1、第一部分肝膽道角蛋白的表達及原發(fā)性膽汁性肝硬化角蛋白基因變異的研究。 目的： 1) 了解肝膽道角蛋白的表達情況2) 探討角蛋白基因變異與原發(fā)性膽汁性肝硬化的關系方法： 從10只1個月大的FVB/n小鼠(雌雄各5只)提取肝臟、膽總管、膽囊及小腸后用高鹽提取(high salt extraction，HSE)和蛋白質(zhì)印跡免疫(western blot)法分析角蛋白表達譜。 2) 提取來自意大利米蘭的原發(fā)性

2、膽汁性肝硬化病人(209例)和健康獻血者(200例)外周全血基因組DNA，用K8/K18/K19全部外顯予引物行遞減聚合酶鏈反應(Touchdown PCR)擴增，擴增產(chǎn)物用變性高效液相色譜(denaturing high performanceliquid chromatography，DHPLC)分析，對有色譜峰改變的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后通過測序分析確定變異部位并分析變異位點在同類角蛋白和不同種屬生物的保守性，最后經(jīng)統(tǒng)計學分析確定角蛋

3、白基因變異與原發(fā)性膽汁性肝硬化的關系。 結(jié)果： 1) 膽總管主要表達K8/K18/K19，也表達少量K7。肝臟、膽總管、膽囊、小腸均以K8表達為主，K18從肝臟到小腸依次減少而K19則相反。K20主要見于小腸，在膽總管僅見小量表達。本實驗末見肝臟表達K7。 2) PBC組和對照組發(fā)現(xiàn)6個有意義的錯義變異，包括K8 3個(G62C、R341H、V380I)、K18 1個(R411H)、K19 2個(G17S、V

4、229M)。 3) 發(fā)現(xiàn)4個新的角蛋白變異，包括3個有意義的錯義變異(K18 R411H、K19 G17S和K19 V229M)，1個同義變異(K19 N184N)，其中K19 V229M僅見于對照組。K19 G17S位于角蛋白結(jié)構(gòu)的頭部而K18 R411H位于的尾部，K19 G17S是首個發(fā)現(xiàn)的K19角蛋白有意義變異，而K18 R411H是首次發(fā)現(xiàn)位于K18尾部的變異。 4) 209例PBC中，能成功進行PCR擴增

5、的有203例，有意義的錯義變異17例，變異率為8.37﹪(17/203)，以K8 R341H最為頻繁(47.1﹪，8/17)，其次是K8 662C(23.5﹪，4/17)，7例為單一雜合子變異，10例病人存在混合變異，即K18 R411H+K18S230T和K19 G17S+IVS2+38G→A混合變異各1例，全部(8例)K8 R341H變異均獨特地伴隨K8IVS7+lODel變異。對照組外顯子變異4例，變異率為2﹪，內(nèi)含子變異3例，全

6、部(3例)K8R341H變異也伴隨K8 IVS7+10Del變異。病例組與對照組角蛋白變異率有顯著性差異(p=0.0059，OR=4.47，CI=1.48-13.56)。 結(jié)論： 1)肝膽道上皮細胞主要表達K8、K18、K19。 2)角蛋白基因變異伴隨原發(fā)性膽汁性肝硬化，是發(fā)病的易患因素之一。 3)新發(fā)現(xiàn)的錯義變異分別位于角蛋白的頭部和尾部，K19 G17S是首個發(fā)現(xiàn)的K19角蛋白有意義變異，而K18

7、R411H是首次發(fā)現(xiàn)位于K18尾部的變異。 創(chuàng)新及意義： 1.首次分析小鼠膽總管角蛋白表達譜，發(fā)現(xiàn)膽總管主要表達K8/K18/K19，僅少量表達K7，該結(jié)果為研究角蛋白在膽總管的功能及其相關疾病提供了理論依據(jù)。 2.首次同時分析原發(fā)性膽汁性肝硬化病人3種角蛋白(K8/K18/K19)的全部編碼基因，發(fā)現(xiàn)角蛋白變異伴隨原發(fā)性膽汁性肝硬化，提示角蛋白變異是發(fā)病的易患因素。 3.發(fā)現(xiàn)2個新的角蛋白變異伴隨原發(fā)

8、性膽汁性肝硬化，即K19 G17S和K18 R411H，分別位于角蛋白主干結(jié)構(gòu)的頭和尾部，K19 G17S是首個發(fā)現(xiàn)的K19角蛋白有意義變異，而K18 R411H是首次發(fā)現(xiàn)位于K18尾部的變異。 第二部分角蛋白基因敲除或突變對胰腺腺泡細胞影響的動物實驗研究。 目的：用無偏差的方法分析角蛋白基因敲除動物胰腺基因表達譜以揭示是否存在角蛋白功能性替代基因。 方法： 1.先用基因芯片分析(Microarry a

9、ssay)缺乏角蛋白表達的12只K8裸鼠胰腺基因譜(用K8野生鼠作為參照)，并用實時逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(real time RT-PCR)方法驗證所得結(jié)果。 2.根據(jù)基因芯片分析結(jié)果，針對改變明顯的基因，選擇具特異性的多肽序列免疫兔產(chǎn)生相應的抗小鼠抗體以檢測蛋白的表達水平，設計相應引物以行PCR擴增或合成探針以檢測mRNA的表達及分布。 3.對已建立的角蛋白缺失(K8或K8或K19裸鼠)、角蛋白絲異常(K18 R89C

10、突變小鼠)、角蛋白磷酸化位點突變(K18 S33A、K18 S52A小鼠)等轉(zhuǎn)基因動物，每一鼠系用2-4只小鼠，并用相應的正常鼠作為對照，通過用實時逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(real timeRT-PCR)、免疫印跡分析(Western Blot)等方法進一步分析基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)的有明顯改變的基因在胰腺組織的表達。 4.用Balb/c小鼠、K8-null、K8-WT鼠建立兩種急性胰腺炎模型，然后用原位雜交(insitu hybrid

11、ization，ISH)、免疫印跡分析(western Blot)等方法分析基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)的有明顯改變的基因在這些炎癥組織的分布和表達。兩種急性胰腺炎模型是分別由膽堿缺乏性飲食(choline-deficient diet，CDD)所誘導的壞死出血性急性胰腺炎和由雨蛙肽(caerulein)所誘導的間質(zhì)水腫性急性胰腺炎，所用小鼠年齡和性別相匹配。CDD飲食誘導模型的建立是：21-25天大、14-19g重的雌性Balb/c小鼠禁食12-

12、16小時后予正常飲食(對照組)或喂飼含0.5﹪乙硫氨酸(ethionine)的膽堿缺乏性飲食，3天后換成正常飲食。caertllelin誘導模型的建立是：予Balb/c小鼠、K8一null、K8-WT鼠禁食(不禁水)12-16小時后腹腔注射生理鹽水(對照組)或50μg/kg caerulein，每小時1次共7次。在實驗指定的時間點用CO<,2>吸入法處死動物取出胰腺，每一時間點含2只小鼠。 結(jié)果： 1) 與K8-WT鼠

13、比較，K8-null鼠胰腺呈現(xiàn)代償性基因譜改變，Reg家族基因上調(diào)，以胰島源性再生因子-Ⅱ(regenerating islet-derived，Reg-Ⅱ)最明顯。 2) Reg-TT是主要的胰腺腺泡細胞產(chǎn)物，除mRNA水平增加外，其蛋白水平也在K8-null鼠明顯增加。 3) Reg-TT不僅在K8缺乏時上調(diào)，也在胞漿角蛋白絲缺乏(K18-null鼠)、胞漿角蛋白絲中斷(K18 R89C)、K18$52A磷酸化定

14、點突變的情況下被誘導。 4) Reg-Ⅱ在兩種急性胰腺炎模型明顯上調(diào)。 5) 在Reg家族中，Reg-TT呈選擇性誘導，Reg-Ⅰ所受影響不如Reg-Ⅱ。 結(jié)論： 角蛋白缺乏或突變誘導胰腺腺泡細胞Reg-Ⅱ明顯上調(diào)，提示Reg-Ⅱ可能功能性地補償胰腺腺泡細胞缺失或異常的角蛋白，是角蛋白異常時激惹的一種替代反應產(chǎn)物以應對外分泌胰腺的損傷。 創(chuàng)新及意義： 1.產(chǎn)生的免抗小鼠Reg-Ⅱ抗體

15、是首次報道的特異性識別Reg-Ⅱ的多克隆抗體，為Reg-Ⅱ的研究提供了有用的工具。 2.發(fā)現(xiàn)胰島源性再生因子Ⅱ(Reg-Ⅱ)在胰腺外分泌細胞角蛋白缺乏、角蛋白絲中斷、磷酸化位點異常時明顯過表達，在角蛋白缺乏的急性炎癥性損傷的胰腺組織表達更為顯著，首次揭示了Reg-Ⅱ與角蛋白在胰腺組織的關系，提示Reg-Ⅱ可能功能性地替代異常的角蛋白以維護細胞結(jié)構(gòu)和功能的完整以及應對組織的損傷，說明胰腺組織損傷時可能存在基因間相互調(diào)節(jié)的自我保護機