凡納濱對蝦血藍蛋白及其功能性肽段抗腫瘤活性的研究.pdf

1、血藍蛋白(hemocyanin，HMC)是位于節(jié)肢動物（螯肢類、甲殼類、多足類和蜘蛛類）和軟體動物（腹足類和頭足類）血淋巴中的含銅呼吸蛋白。一般認為，血藍蛋白的主要生物學功能與機體內(nèi)的輸氧有關，有意思的是，近年來學者們發(fā)現(xiàn)軟體動物血藍蛋白還具有抗腫瘤活性。然而，迄今為止，對蝦血藍蛋白及其功能性肽段是否具有抗腫瘤活性尚不清楚。為此，本研究以凡納濱對蝦血藍蛋白及其小分子合成肽（HMC-P）為研究對象，在課題組已有研究基礎之上，進一步采用細胞

2、生物學、分子免疫學、實驗動物學和蛋白質(zhì)組學等策略對其進行了較為深入的研究，所獲主要研究結果如下：
　　1、對蝦血藍蛋白抗腫瘤活性
　　1）體外水平
　　課題組前期采用Sulfordmaine B(SRB)、DNA ladder、蛋白質(zhì)組學和熒光定量PCR等技術發(fā)現(xiàn)對蝦血藍蛋白對HeLa細胞有較強的增殖抑制和潛在促凋亡作用。在此基礎之上，本論文進一步檢測血藍蛋白刺激HeLa細胞后其內(nèi)部活性氧（ROS）、線粒體膜電位以及C

3、aspase-3/9酶活性等的變化情況。結果表明，20-100μg/mL（Caspase-3/9酶活性檢測：20-60μg/mL）血藍蛋白與HeLa細胞共培養(yǎng)24 h后，HeLa細胞可發(fā)生明顯的ROS爆發(fā)現(xiàn)象，線粒體膜電位顯著降低，Caspase-3/9的酶活性明顯上升，與陰性對照相比，均存在顯著性（p<0.05）或極顯著性差異（p<0.01）。由此推測，對蝦血藍蛋白體外抗腫瘤活性的作用機制可能為線粒體介導的程序性凋亡機制。
　　

4、2）體內(nèi)水平
　　在上述研究基礎之上，進一步以S180荷瘤小鼠為腫瘤模型，采用腹腔注射的方法探索血藍蛋白體內(nèi)抗腫瘤活性情況。結果發(fā)現(xiàn)，2-6 mg/kgbw/d劑量血藍蛋白處理荷瘤小鼠8天后，S180實體瘤的生長得以明顯的抑制，其中中劑量組（4mg/kgbw/d）抑瘤率為49％，與模型組和對照組（BSA）相比，其抑瘤率、瘤體積、肝指數(shù)、脾指數(shù)等均存在顯著性差異（p<0.05）或極顯著性差異（p<0.01）。
　　生化指標結果

5、顯示，實驗組血清和肝臟中的超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量顯著上升或下降，其中，血藍蛋白中劑量組（肝臟MDA除外）與模型組和對照組（BSA）相比，存在極顯著性差異（p<0.01）。
　　非特異性免疫功能分析發(fā)現(xiàn)，血藍蛋白各劑量組均可以顯著提高小鼠血清中的TNF-α水平、NK細胞殺傷活性和脾淋巴細胞的增殖能力，與模型組和對照組（BSA）相比，均存在顯著性差異（p<0.05）或極顯著性差異（p<0.01）。
　

6、　HE切片病理組織學分析表明，與模型組和對照組（BSA）相比，實驗組腫瘤細胞排列松散、細胞變圓變小、腫瘤組織出現(xiàn)較大面積壞死灶和纖維化組織結構。
　　這些研究結果說明，血藍蛋白不僅對S180荷瘤小鼠具有明顯抗腫瘤活性，而且對機體還有一定的保護效果。
　　2、對蝦血藍蛋白功能性肽段抗腫瘤活性
　　基于課題組前期發(fā)現(xiàn)12種對蝦血藍蛋白功能性肽段（命名為HMC-P）對6種病原菌具有抑菌活性的研究結果，本研究進一步采用SRB、

7、DNA Ladder、DAPI染色、Annexin V-FITC/PI雙熒光染色等技術對其抗腫瘤活性進行了初步的研究。結果發(fā)現(xiàn)，3種（B10、B11和S7）HMC-P（50μg/ml）分別對HeLa、EC109細胞的生長具有明顯的抑制活性，其抑制率為40%-53%；該3種HMC-P處理HeLa細胞24h后，可使細胞產(chǎn)生明顯的DNA片段化，同時可導致細胞變圓、皺縮、形成核小體，并出現(xiàn)細胞膜外翻現(xiàn)象。由此說明，對蝦血藍蛋白功能性肽段應該同樣