三七總皂苷促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞源血管生成.pdf

1、目的:
　　研究三七總皂苷(total saponins of Panax notoginseng，tPNS)對源自大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells，rBMSCs)的血管新生的影響，獲得tPNS與BMSCs聯(lián)合應(yīng)用有助于BMSCs的存活和血管生成的實驗資料，為解決BMSCs移植治療心肌梗死時，細胞在心肌缺血微環(huán)境下存活率低影響臨床應(yīng)用的難題提供新思路。
　　方

2、法:
　　1.rBMSCs的分離、純化與鑒定。
　　采用密度梯度分離法，從大鼠骨髓中分離BMSCs，并于體外純化、擴增。流式細胞術(shù)檢測rBMSCs的表面標志CD29+、CD106+、CD44+和CD45+。
　　2.rBMSCs增殖及tPNS的影響
　　將BMSCs接種于96孔板培養(yǎng)，tPNS(0，0.03，0.1，0.3，1，3，10，30，100，300μg/mL)刺激48h，MTT法，酶標儀490nm檢測O

3、D值，以O(shè)D值代表細胞增殖率。以此實驗結(jié)果為依據(jù)確定本實驗的tPNS低、中、高濃度，MTT法檢測培養(yǎng)10d細胞生長曲線。
　　3.細胞培養(yǎng)上清中VEGF含量檢測
　　rBMSCs接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，tPNS刺激（0，1，10，100μg/mL），分別于第2、4、6、8、10d收集培養(yǎng)上清，ELISA檢測培養(yǎng)上清中VEGF濃度。
　　4.細胞VEGF基因表達的檢測
　　rBMSCs接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶，

4、tPNS刺激(0，1，10，100μg/mL)48h，Trizol Reagenl提取總RNA，在qRT-PCR儀上用一步法檢測VEGF基因表達量。
　　5.rBMSCs的內(nèi)皮誘導(dǎo)及體外血管新生實驗
　　用含EGM-2的HG-DMEM內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)BMSCs14 d，免疫細胞化學(xué)及免疫熒光染色檢測Ⅷ因子相關(guān)抗原、荊豆凝集素并行細胞攝取Dil-ac-LDL實驗。
　　體外血管新生實驗用Matrigel基質(zhì)膠內(nèi)皮細胞管

5、形成分析實驗?zāi)Ｐ汀?br>　　6.rBMSCs聯(lián)合Matrigel移植在體血管生成實驗
　　實驗分為空白對照組、實驗對照組、tPNS低、中、高濃度組。rBMSCs與冰浴中的Matrigel等量混合，取400μl皮下注射于SD大鼠腹前區(qū)正中線兩側(cè)，空白對照組以等量培養(yǎng)液代替rBMSCs。術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)，按實驗分組腹腔注射血栓通（50μg/kg，低濃度組;100μg/kg，中濃度組;150μg/kg，高濃度組。）或生理鹽水（對照組）。1

6、0d終止實驗，取出Matrigel移植體，分別測定其血紅蛋白含量和VEGF含量，部分種植體組織切片，Masson染色，檢測微血管面積。
　　結(jié)果:
　　1.rBMSCs形態(tài)學(xué)特征及流式細胞術(shù)鑒定
　　細胞接種48h，首次換液后，貼壁細胞呈梭形或為體積較大的圓形單個核細胞。4d后，可見紡錘形貼壁細胞。6d后，多個細胞形成集落。傳代后，細胞體積增大，呈長梭形，成纖維細胞樣。融合的細胞單層呈渦旋狀。流式細胞術(shù)檢測第四代rBM

7、SCs表面抗原，CD29+陽性細胞數(shù)為77.1％，CD44+陽性細胞為21.3％，CD106+和CD45+陽性細胞分別為5.5％和4.0％。
　　2.tPNS對rBMSCs增殖能力的影響。
　　tPNS促進rBMSCs細胞增殖。tPNS刺激細胞48h，濃度從0.03至100μg/mL范圍內(nèi)，均有促細胞增殖作用。取1.0μg/mL、10.0μg/mL和100μg/mL為tPNS的低，中，高濃度組。連續(xù)檢測10d細胞增殖率，結(jié)果

8、顯示，培養(yǎng)第2至6天，tPNS低，中，高濃度組分別較對照組增高13.7％～36.7％、35.5％～65.2％和23.3％～70.8％，均P＜0.01;第8天以后，增殖率與對照組比較雖仍有增高，但增高幅度較小。
　　3.tPNS促進rBMSCs分泌VEGF
　　在對照組，細胞培養(yǎng)至第2，4，6，8，10天，培養(yǎng)上清中VEGF濃度分別為682.7±128.4pg/mL、830.6±71.0 pg/mL、778.8±63.9 pg

9、/mL、802.7±49.3 pg/mL和683.7±194.1 pg/m。與對照組比較，tPNS低、中、高濃度組細胞培養(yǎng)至第4至10天，VEGF濃度分別較對照組增高20.3％～28.5％，67.9％～109.3％和101.0％～248.1％，均P＜0.01。
　　4.tPNS上調(diào)rBMSCs的VEGF基因表達
　　實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測結(jié)果表明，tPNS上調(diào)VEGF mRNA水平。與對照組比較，tPNS的低，中、高濃

10、度組分別增高36％、22％和89％，P＜0.01或P＜0.05。
　　5.tPNS促進rBMSC-ECs體外血管新生
　　第三代rBMSCs用內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)，14d后分化為內(nèi)皮樣細胞(rBMSC-EC)，rBMSC-ECs在Matrigel基質(zhì)膠上培養(yǎng)24h，形成毛細血管樣結(jié)構(gòu)。tPNS組管的數(shù)量和管的長度均較對照組明顯增加。毛細管總長度為對照組的2.17倍（1μg/mL組）、1.42倍（10μg/mL組）和1.90倍（

11、100μg/mL組），P＜0.05或P＜0.01。
　　6.tPNS促進rBMSCs聯(lián)合Matrigel移植在體血管生成
　　Matrigel移植體血紅蛋白含量:空白對照組Hb含量很低，實驗對照組是空白對照組的1.8倍，P＜0.01;tPNS低、中、高濃度組分別是實驗對照組的1.38倍、1.51倍和1.69倍，均P＜0.01。Matrigel移植體VEGF濃度:實驗對照組較空白對照組增高3.11倍，P＜0.01，tPNS低、