侵襲性T細(xì)胞淋巴瘤自體造血干細(xì)胞移植后隨訪結(jié)果和CD4+CD25+Treg細(xì)胞調(diào)節(jié)異基因移植后GVHD和GVL的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的:外周T細(xì)胞淋巴瘤是發(fā)生率相對較低同時(shí)又是異質(zhì)性明顯的一組非霍奇金淋巴瘤。亞洲地區(qū)發(fā)病率高于歐美。與B細(xì)胞淋巴瘤相比，臨床診斷時(shí)，PTCL病程相對較晚期，PS評分高，結(jié)外病變、B癥狀、LDH比例高、骨髓侵犯多見。因此PTCL預(yù)后比B細(xì)胞淋巴瘤差，表現(xiàn)為化療有效率低，復(fù)發(fā)率高，總生存時(shí)間短。由于缺乏PTCL各種亞型的前瞻性臨床研究結(jié)果指導(dǎo)，目前PTCL的治療策略主要借鑒B細(xì)胞淋巴瘤的經(jīng)驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)劑量的CHOP方案僅能治愈少數(shù)早期的P

2、TCL患者，但對大部分PTCL患者而言，目前其治愈率仍很低。采用高劑量強(qiáng)度方案治療PTCL，其無進(jìn)展生存和總生存上并未明顯超越標(biāo)準(zhǔn)劑量的CHOP方案。如類似兒童Burkitt淋巴瘤的強(qiáng)烈治療方案只是提高了總有效率，而并未明顯延長無事件生存。由較新細(xì)胞毒藥物如吉西他濱、噴妥司汀、拓?fù)涮婵档冉M成的方案，顯示一定療效，但仍在初步的臨床研究中。由于PTCL分化和抗原表達(dá)的異質(zhì)性，單克隆抗體治療包括CD2，CD4，CD5，CD7，CD25，CD3

3、0和CD52等，只能針對相應(yīng)的PTCL亞型，而且仍在研究當(dāng)中。目前因缺乏前瞻性、隨機(jī)對照的大規(guī)模臨床試驗(yàn)結(jié)果，自體造血干細(xì)胞移植(AHSCT)治療PTCL盡管取得了明顯的進(jìn)步，但其臨床作用仍未明確，大部分回顧性臨床研究認(rèn)為復(fù)發(fā)難治性的PTCL在AHSCT治療后可以獲得優(yōu)于常規(guī)挽救化療方案的治療效果，因此，多數(shù)醫(yī)生考慮下列治療選擇，不管ALK狀態(tài)，PTCL復(fù)發(fā)后均應(yīng)考慮接收AHSCT治療的。而對于ALK—的初治PTCL，尤其具是2個(gè)以上有

4、不良預(yù)后因素(a—IPI2～3分者及B2-MG升高)者，推薦一線嘗試采用AHSCT治療，并進(jìn)一步考察AHSCT在PTCL中的作用。回顧性臨床研究顯示AHSCT可以為PTCL帶來生存受益，但仍有約23～59％移植后評價(jià)CR的患者復(fù)發(fā)。同時(shí)也有初步的資料顯示allo—HSCT可能為病程較晚、既往復(fù)雜治療和(或)骨髓侵犯的患者帶來PFS和OS的益處。對于一線或挽救性AHSCT失敗后患者，可考慮選用傳統(tǒng)或減低預(yù)處理強(qiáng)度的異基因HSCT的臨床試驗(yàn)

5、。 allo—HSCT的優(yōu)點(diǎn)是輸入移植物無淋巴瘤污染，并有潛在的移植物抗淋巴瘤(GVL)效應(yīng)。但清髓性移植后的生存因較高的非復(fù)發(fā)死亡率而受影響，主要原因是移植物抗宿主病(GVHD)。同時(shí)GVL帶來的有效性常伴隨對宿主正常組織有害的GVHD反應(yīng)。因此目前異基因移植的焦點(diǎn)是將有效的GVL效應(yīng)與GVHD分離。我們復(fù)習(xí)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)能明確抑制GVHD同時(shí)保留GVL作用的策略包括T調(diào)節(jié)細(xì)胞的輸注，新型藥物和生物制劑的使用。 西羅莫司(S

6、irolimus)是一種哺乳類雷帕霉素靶分子(mTOR)抑制劑，西羅莫司與FK結(jié)合蛋白12(FKBP12)、mTOR蛋白結(jié)合形成復(fù)合物。這種西羅莫司—FK蛋白12-mTOR復(fù)合物抑制幾條旁路，導(dǎo)致DNA轉(zhuǎn)錄、DNA翻譯、蛋白質(zhì)合成減少、細(xì)胞周期阻滯，并導(dǎo)致T細(xì)胞的免疫抑制和樹突狀細(xì)胞的功能受損。此外在動物實(shí)驗(yàn)中，西羅莫司可以擴(kuò)增CD4+CD25+Foxp3調(diào)節(jié)T細(xì)胞，且GVL未受影響。 抗CD25單抗是一種新型免疫抑制劑，可以與

7、α鏈結(jié)合后可阻滯活化T細(xì)胞上的高親和力IL—2受體，并抑制IL—2介導(dǎo)的IL—2受體依賴性的激活通路。阻滯IL—2對淋巴細(xì)胞的活化和增值作用可能是其作用的主要機(jī)制。 活化的CD4+CD25+Treg細(xì)胞通過以下機(jī)制發(fā)揮其抑制效應(yīng)T細(xì)胞的作用：與抗原提呈細(xì)胞的功能、直接接觸抑制作用于效應(yīng)性T細(xì)胞、分泌可溶性細(xì)胞因子，如IL-10、TGF—β等。在小鼠的異基因模型中發(fā)現(xiàn)，輸注CD4+CD25+Treg細(xì)胞可以抑制急性GVHD反應(yīng)和移

8、植物排斥反應(yīng)同時(shí)保留GVL作用，當(dāng)剔除CD4+CD25+Treg細(xì)胞時(shí)可放大GVHD反應(yīng)。 總而言之，西羅莫司、抗CD25單抗、CD4+CD25+Treg都有抑制GVHD同時(shí)保留GVL的潛在優(yōu)勢。本研究擬比較中三者療效的優(yōu)劣。 方法與結(jié)果: 第一部分：侵襲性T細(xì)胞性淋巴瘤自體造血干細(xì)胞移植后隨訪結(jié)果評價(jià)自體造血干細(xì)胞移植(Autologoushematopoieticstemcelltransplantation

9、，AHSCT)治療侵襲性T細(xì)胞性非霍奇金淋巴瘤(T—NHL)的臨床療效及安全性。 本文回顧性分析1994年～2008年間，我院收治的AHSCT治療后長期隨訪的侵襲性T—NHL36例，初治11例(30.6％)，復(fù)發(fā)11例(30.6％)和難治性病例14例(38.9％)。病理類型包括T淋巴母細(xì)胞淋巴瘤16例(44.4％)、間變大細(xì)胞性淋巴瘤8例(22.2％)和外周T非特異型淋巴瘤5例(13.9％)。 36例患者接收自體造血干細(xì)

10、胞移植，35例患者可評價(jià)療效，1例移植后失訪。中位隨訪23(8-132)月，中位無進(jìn)展生存時(shí)間(PFS)38.7個(gè)月，預(yù)計(jì)1年、3年和5年無進(jìn)展生存率分別為56％，46％和46％。預(yù)計(jì)中位總生存時(shí)間54月，1年、3年和5年總生存率分別為69％，58％，49％。移植后17例(48.6％)患者復(fù)發(fā)，4例患者仍帶瘤生存。移植前為難治性病例和骨髓侵犯是本組患者不良預(yù)后相關(guān)的因素。主要Ⅲ～Ⅳ度不良反應(yīng)為發(fā)熱(51.6％)、口腔潰瘍(32.3％)；

11、1例治療相關(guān)死亡。 第二部分：CD4+CD25+Treg細(xì)胞調(diào)節(jié)異基因移植后的GVHD和GVL的實(shí)驗(yàn)研究 第一章：GVHD模型及腫瘤模型的建立； 方法： 步驟1：雌性C57/BL6(H2Kb)受鼠接受致死劑量12Gy的放療，并在放療24小時(shí)內(nèi)尾靜脈注射來源于異基因供鼠BALB/c(H2Kd)不同數(shù)量級的骨髓細(xì)胞。 結(jié)果1:5.0×106的骨髓細(xì)胞是移植成功的最低限。 步驟2：受鼠接受致死劑

12、量的放療后，接受異基因供鼠來源的骨髓細(xì)胞和不同數(shù)量級的脾淋巴細(xì)胞的共同移植。 結(jié)果2：脾淋巴細(xì)胞的比例和數(shù)量是調(diào)節(jié)GVHD程度的重要因素。35×106是造成致死性GVHD的最低劑量。 步驟3：正常小鼠和放療后小鼠皮下分別接種不同數(shù)量的淋巴瘤細(xì)胞。 結(jié)果3:107的淋巴瘤細(xì)胞是正常小鼠成瘤的最低劑量。105的細(xì)胞可以使放療后的小鼠成瘤。 步驟4：受鼠接受致死劑量的放療后2小時(shí)內(nèi)，予或不予皮下接種腫瘤細(xì)胞株，

13、并予異基因骨髓細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞的共同移植。 結(jié)果4：單純移植的小鼠長期存活超過90天，接種淋巴瘤細(xì)胞的小鼠移植后因腫瘤進(jìn)展死亡，死亡時(shí)無GVHD反應(yīng)，中位生存時(shí)間26天。 第二章：CD4+CD25+Treg細(xì)胞的分離純化和體外功能測定； 方法： CD4+CD25+Treg細(xì)胞是脾淋巴細(xì)胞單個(gè)核懸液用CD25-PE抗體和與PE結(jié)合的磁珠通過全自動磁珠分選(AutoMACS)系統(tǒng)濃縮后得到。用流式細(xì)胞儀檢測與

14、FITC、PE抗體結(jié)合的CD69，CTLA—4和CD45RO。用MTT法檢測CD4+CD25+Treg細(xì)胞隊(duì)混合淋巴細(xì)胞的影響。 結(jié)果： ①CD4+CD25+Treg的純度常規(guī)可達(dá)80.5％以上。流式測定CD4+CD25+TregCD69的表達(dá)為2.9％，CD45RO的表達(dá)為90.5％，CTLA—4的表達(dá)為91.2％。 ②在CD4+CD25+Treg細(xì)胞與混合淋巴細(xì)胞比例為1:1時(shí)，抑制率為49.33％。

15、 第三章：西羅莫司、抗CD25抗體、CD4+CD25+Treg細(xì)胞調(diào)節(jié)異基因移植后GVHD和GVL的試驗(yàn)研究 方法：A、B、C、D組受鼠接受致死劑量放療后2小時(shí)內(nèi)皮下接種腫瘤細(xì)胞株，并予異基因骨髓細(xì)胞和脾細(xì)胞共同移植。B、C、D組分別予西羅莫司、抗CD25抗體、CD4+CD25+Treg細(xì)胞治療。E組為未加脾細(xì)胞和其他治療的單純骨髓細(xì)胞移植。 結(jié)果： ①CD4+CD25+Treg細(xì)胞治療的D組生存時(shí)間超過60天，

16、可明顯抑制致死性GVHD反應(yīng)，延長腫瘤的形成，且腫瘤體積為最小。 ②B組、C組中位生存時(shí)間分別是33和42天?？笴D25抗體抑制GVHD似乎更優(yōu)于西羅莫司，但2組的小鼠大部分死于腫瘤進(jìn)展。 結(jié)論: 1.AHSCT治療初治晚期或常規(guī)化療后復(fù)發(fā)的外周T細(xì)胞淋巴瘤是安全有效的，但復(fù)發(fā)率仍偏高，值得開展大規(guī)模的臨床試驗(yàn)進(jìn)一步深入研究2.CD4+CD25+Treg細(xì)胞可以明顯抑制GVHD，并有部分GVL作用。 3.