Bec lin1基因的選擇性剪接研究及條件敲除小鼠的建立.pdf

1、本文對Bec lin1基因的選擇性剪接研究及條件敲除小鼠的建立進(jìn)行了研究。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：
　　目的：研究兒童急性B淋巴細(xì)胞白血病697細(xì)胞系中的Bec lin1基因的選擇性剪接及其對自噬的調(diào)控作用。
　　方法：⑴提取697細(xì)胞系的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。⑵在Beclin1基因的ORF區(qū)的起始密碼子上游和終止子的下游設(shè)計(jì)引物,以cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序和比對。⑶分析剪接體Del-E1

2、1產(chǎn)生的分子機(jī)制。⑷構(gòu)建GFP-剪接體融合表達(dá)的慢病毒載體,研究其亞細(xì)胞定位。⑸構(gòu)建剪接體融合表達(dá)的697細(xì)胞系,通過western blot和Co-IP的方法檢測De l-E11對細(xì)胞自噬的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：①在兒童急性B淋巴細(xì)胞白血病697細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)一個新的Beclin1基因剪接體,該剪接體第11號外顯子缺失,導(dǎo)致翻譯提前終止,形成的肽鏈和Bec lin1相比在C端缺少了95個氨基酸。②成功構(gòu)建Lenti-GFP-Bec

3、lin1和Lenti-GFP-Del-E11融合基因的慢病毒表達(dá)載體,包裝病毒后,侵染 He la細(xì)胞,得到陽性的He la-GFP-Bec lin1和Hela-GFP-Del-E11細(xì)胞,western blot檢測結(jié)果表明融合基因正常轉(zhuǎn)錄并翻譯成相應(yīng)蛋白。③亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明De l-E11蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。④過表達(dá)De l-E11抑制697細(xì)胞系中的自噬活性。
　　結(jié)論：⑴生物信息學(xué)分析表明, Bec lin1基因

4、的缺失突變體 Del-E11是由于pre-mRNA選擇性剪接時(shí)發(fā)生外顯子跳躍形成的。⑵De l-E11蛋白與野生型的Bec lin1蛋白在細(xì)胞質(zhì)中均有分布,表明二者在亞細(xì)胞定位方面沒有明顯變化。⑶由于De l-E11蛋白與Vps34結(jié)合的能力下降,導(dǎo)致697-De l-E11細(xì)胞的自噬水平顯著低于697-Beclin1細(xì)胞的自噬水平,表明 De l-E11對自噬具有負(fù)調(diào)控作用。
　　第二部分：
　　目的：建立Beclin1基

5、因條件敲除小鼠模型。
　　方法：⑴NeoR滋養(yǎng)層細(xì)胞的制備。⑵限制性內(nèi)切酶As iS I線性化Bec lin1打靶載體。⑶小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ES)的培養(yǎng)、ES細(xì)胞的電穿孔及陽性ES克隆的篩選和鑒定。⑷制備結(jié)扎公鼠及假孕雌鼠。⑸雌鼠動情周期的判定和超數(shù)排卵。⑹小鼠胚胎的獲取、顯微注射和胚胎移植。⑺嵌合體的篩選與繁育。⑻N(yùn)4代Beclin1f/+小鼠的基因型鑒定與繁育。⑼Va v-Bec lin1

6、+/-小鼠的基因型鑒定。
　　結(jié)果：①從144個中靶的ES細(xì)胞克隆中鑒定出18個陽性的ES細(xì)胞克隆。②選取3株陽性ES克隆,共注射145枚囊胚,移植給10只假孕雌鼠,產(chǎn)生24只嵌合體,其中雄鼠14只,雌鼠10只。③篩選出4只嵌合度在50％以上的雄鼠進(jìn)行繁育,最終共獲得19只N4代小鼠,其中有12只是Bec lin1f/+小鼠。④獲得4只Va v-Bec lin1+/-小鼠。
　　結(jié)論：成功建立Beclin1基因條件打靶小鼠模