稻縱卷葉螟魚(yú)尼丁受體基因和鈉離子通道基因的克隆與選擇性剪接分析.pdf

1、稻縱卷葉螟CnaphalocrocismedinalisGuenée(鱗翅目Lepidoptera，螟蛾科Pyralididae)，是亞熱帶國(guó)家水稻Oryzasativa(L.)（禾本目Poaceae，禾本科Graminales）最嚴(yán)重的食葉害蟲(chóng)之一。近年來(lái)，稻縱卷葉螟在我國(guó)南方以及長(zhǎng)江中下游稻區(qū)的發(fā)生和危害日趨嚴(yán)重。目前化學(xué)防治仍是有效控制稻縱卷葉螟為害的主要手段。隨著害蟲(chóng)對(duì)現(xiàn)有殺蟲(chóng)劑抗性的快速發(fā)展，研發(fā)具有新型作用機(jī)制的殺蟲(chóng)劑至關(guān)重

2、要。本文克隆了稻縱卷葉螟魚(yú)尼丁受體和鈉離子通道基因，分析了魚(yú)尼丁受體和鈉離子通道基因剪接異構(gòu)體在稻縱卷葉螟不同發(fā)育階段和成蟲(chóng)不同組織部位的表達(dá)模式，研究結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步豐富對(duì)昆蟲(chóng)魚(yú)尼丁受體和鈉離子通道結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的認(rèn)識(shí)以及新型高效殺蟲(chóng)劑的創(chuàng)制具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。
　　 魚(yú)尼丁受體(ryanodinereceptor,RyRs)是一類(lèi)控制Ca+從胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放的配基門(mén)控鈣離子通道。RyRs是兩類(lèi)新型化學(xué)合成殺蟲(chóng)劑鄰苯二甲酰

3、胺類(lèi)和鄰甲酰氨基苯甲酰胺類(lèi)的作用靶標(biāo)。RyRs全長(zhǎng)cDNA克隆是了解昆蟲(chóng)RyRs結(jié)構(gòu)和功能特性以及二酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑選擇性作用機(jī)制的關(guān)鍵。本文通過(guò)反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(RT-PCR)和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)克隆了稻縱卷葉螟RyR全長(zhǎng)cDNA，命名為CmRyR。CmRyR開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)15264bp，編碼5087個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為574339Da。氨基酸序列比對(duì)表明，CmRyR與家蠶和果蠅的RyR序列一致性分別

4、為94％和79％。CmRyR與已知RyRs具有共同的結(jié)構(gòu)特征。分別位于CmRyR蛋白C末端4183-4194位和4285-4296位的兩個(gè)EF-hands表明CmRyR與哺乳動(dòng)物RyRs一樣，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放。CmRyR在通透離子的包括選擇性濾孔基序(GGGXGD)的孔道區(qū)與哺乳動(dòng)物RyRs高度相似，表明CmRyR可形成功能性Ca2+通道。多重序列比對(duì)表明，對(duì)應(yīng)于CmRyRN4922，N4924，N4935，L4950，L49

5、81，N5013和T5064的氨基酸殘基在鱗翅目昆蟲(chóng)中完全一致，相應(yīng)位置的與鱗翅目昆蟲(chóng)不同的氨基酸殘基在非鱗翅目昆蟲(chóng)和其他無(wú)脊椎動(dòng)物以及脊椎動(dòng)物RyRs中高度保守，推測(cè)這些氨基酸殘基可能在鱗翅目和非鱗翅目昆蟲(chóng)RyRs通道特性差異以及二酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑選擇性毒性方面具有重要作用。此外，在CmRyR基因中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)選擇性剪接位點(diǎn)，其中之一位于第二個(gè)SPRY結(jié)構(gòu)域中央部分。特異性PCR檢測(cè)表明，互斥外顯子(a/b)的表達(dá)具有發(fā)育階段和組織特異性。在

6、卵和成蟲(chóng)頭部的所有cDNA克隆中都檢測(cè)到外顯子a，但蛹的23個(gè)cDNA克隆中和成蟲(chóng)身體的21個(gè)cDNA克隆中分別檢測(cè)到16和11個(gè)外顯子a。相反，外顯子b在卵和成蟲(chóng)頭部沒(méi)有檢測(cè)到，但在蛹和成蟲(chóng)身體中低至中等頻率表達(dá)(30％和48％)。另外，選擇性外顯子c的表達(dá)也具有發(fā)育階段特異性。在卵、3齡幼蟲(chóng)和5齡幼蟲(chóng)中，外顯子c低頻率（0％，17％和10％）表達(dá)，但在1齡幼蟲(chóng)和蛹中，外顯子c中等至高頻率(55％和71％）表達(dá)。這些結(jié)果表明選擇性剪接

7、可能是稻縱卷葉螟以及其他昆蟲(chóng)RyR通道產(chǎn)生功能多樣性的主要方式。
　　 電壓門(mén)控鈉離子通道是擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的作用靶標(biāo)，昆蟲(chóng)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性的一個(gè)重要機(jī)制稱為擊倒抗性。鈉離子通道在害蟲(chóng)抗藥性中的重要作用推動(dòng)了昆蟲(chóng)鈉離子通道的研究。新型高效殺蟲(chóng)劑茚蟲(chóng)威作用于失活態(tài)鈉離子通道，破壞神經(jīng)沖動(dòng)傳遞，是替代有機(jī)磷和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的理想品種，目前已經(jīng)在我國(guó)部分地區(qū)用于稻縱卷葉螟的防治。本文利用RT-PCR和RACE克隆獲得