敲低亮氨酰-tRNA合成酶表達對惡性膠質(zhì)瘤細胞生物學行為影響的體外研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是臨床上最常見的原發(fā)性惡性腦腫瘤，其中多形性膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是最常見、惡性程度最高的膠質(zhì)瘤。雖然在過去幾年膠質(zhì)瘤的研究取得了很大進步，但惡性膠質(zhì)瘤病人的預后仍然很差。膠質(zhì)母細胞瘤是一種多基因和多信號通路異常的疾病，目前對其發(fā)病機制仍不是很清楚。
　　近來研究發(fā)現(xiàn)，亮氨酰-tRNA合成酶（leucyl-tRNA synthetase，LARS）除其催化亮氨酰-tRNA合成的

2、經(jīng)典功能外，還具有非經(jīng)典功能，是腫瘤相關(guān)基因。但LARS在膠質(zhì)瘤中的研究鮮有報道。MicroRNAs(miRs)是一類小的非編碼RNA，負責轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達。研究表明miRs在多種腫瘤（包括膠質(zhì)瘤）中異常表達，扮演癌基因或抑癌基因的作用。目前尚不清楚LARS是否與miRs存在關(guān)系。
　　本課題研究的主要目的是探討LARS基因在惡性膠質(zhì)瘤中的表達和對膠質(zhì)瘤細胞生物學行為的影響以及miR-451與LARS基因表達關(guān)系，為揭開膠質(zhì)瘤的

3、發(fā)病機制、開拓新的治療策略和靶點提供線索。
　　第一部分應用熒光實時定量PCR(real-time PCR)和蛋白印跡法(westernblot)檢測了9個惡性膠質(zhì)瘤細胞系和1例正常腦組織的LARS表達量，結(jié)果顯示LARS在9個惡性膠質(zhì)瘤細胞系和1例正常腦組織均有表達且在9個惡性膠質(zhì)瘤細胞系中的表達量明顯高于正常腦組織(P＜0.05)，PCR和western blot結(jié)果相一致。又運用免疫組化法檢測了LARS在含有75例膠質(zhì)瘤和5

4、例瘤旁正常腦組織的組織芯片中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LARS在膠質(zhì)瘤中的表達要明顯高于在正常腦組織中的表達(P＜0.05)，與膠質(zhì)瘤級別成正相關(guān)，但相關(guān)程度不高(r=0.283，P＜0.05)，且Ⅰ/Ⅱ級和Ⅲ/Ⅳ級膠質(zhì)瘤之間LARS表達差異不明顯(P＞0.05)。由此，我們得出結(jié)論LARS在人腦膠質(zhì)瘤中過表達，可能參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和進展。
　　第二部分利用LARS小干擾RNA(LARS siR)技術(shù)探討了敲低LARS表達對惡性膠質(zhì)瘤細胞系

5、U251和SNB19生物學行為的影響及可能的機制。首先，利用real-time PCR和western blot實驗方法檢測了轉(zhuǎn)染LARS siR后LARS基因的表達變化，結(jié)果顯示LARS siR可以有效敲低LARS表達。緊接著敲低LARS表達后，利用MTT法分析了細胞增殖活性，細胞平板克隆形成實驗分析了細胞群體依賴性和增殖能力，流式細胞術(shù)分析了細胞周期分布，劃痕、transwell實驗分析了細胞遷移侵襲能力，annexin-Ⅴ法檢測了

6、細胞凋亡率，western blot分析相關(guān)蛋白表達情況。結(jié)果表明敲低LARS表達抑制了惡性膠質(zhì)瘤細胞的生長增殖能力，阻滯細胞周期在G0/G1期，降低了細胞遷移侵襲能力，下調(diào)了哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1（mammalian target of rapamycin complex1，mTORC1）信號通路的活性，但對細胞凋亡沒有明顯的影響。由此，我們得出結(jié)論LARS基因可能在膠質(zhì)瘤細胞通過mTORC1信號通路扮演癌基因的作用，有望成為

7、治療膠質(zhì)瘤的一個新的基因靶點。
　　第三部分利用人工合成寡核苷酸miR-451 mimics和miR-451 inhibitor探討了miR-451與LARS的靶向調(diào)控關(guān)系。結(jié)果顯示miR-451 mimics和inhibitor可以有效上調(diào)和下調(diào)miR-451在細胞內(nèi)的表達，且與LARS蛋白表達呈負相關(guān)。構(gòu)建LARS3，-UTR雙熒光素酶質(zhì)粒，通過雙熒光素酶報告實驗進一步研究了miR-451調(diào)控LARS表達的機制:LARS是mi