孕期慢性應(yīng)激對(duì)子代學(xué)習(xí)記憶能力影響及其干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過(guò)建立孕期慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激大鼠(Chronicunpredictablemild stress, CUMS)模型，在行為學(xué)、組織學(xué)、分子基因不同水平下，系統(tǒng)的觀(guān)察大鼠孕期處于應(yīng)激狀態(tài)對(duì)母體生殖功能及母體、子代的學(xué)習(xí)記憶能力、情緒的影響，且從海馬神經(jīng)遞質(zhì)和可塑性出發(fā)，探討損傷的可能機(jī)制，并經(jīng)過(guò)豐富環(huán)境來(lái)進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力損傷干預(yù)的機(jī)制探討，為深入理解和預(yù)測(cè)應(yīng)激的遺傳性危害及下一步人群流行病學(xué)研究及干預(yù)提供科學(xué)依據(jù)。
　　方

2、法：選用Wistar雌性成年大鼠20只，隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組，模型組連續(xù)21天采用單籠飼養(yǎng)和慢性輕度不可預(yù)知應(yīng)激造模(在第3天開(kāi)始交配)；1)動(dòng)態(tài)觀(guān)察母鼠體重變化，采用放射免疫法測(cè)定血漿皮質(zhì)酮水平，敞箱實(shí)驗(yàn)測(cè)定行為學(xué)改變，糖水消耗實(shí)驗(yàn)測(cè)定液體消耗，檢測(cè)生殖有關(guān)的基本情況；測(cè)定子鼠血漿皮質(zhì)酮濃度，采用Morris水迷宮、Y迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定子鼠學(xué)習(xí)記憶能力，利用液體消耗實(shí)驗(yàn)、敞箱實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)測(cè)定子鼠情緒變化的測(cè)定，并分析其變化；2)采用HE

3、染色和電鏡進(jìn)行子鼠腦海馬形態(tài)學(xué)觀(guān)察，ELISA方法測(cè)定腦海馬組織各類(lèi)中樞神經(jīng)遞質(zhì)含量及活性，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western Blotting測(cè)定海馬組織中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 BDNF、IGF-Ⅱ、核轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB，海馬中突觸可塑性相關(guān)蛋白Arc表達(dá)情況，并分析其相關(guān)性；3)給予孕期慢性應(yīng)激及對(duì)照組子代組分別豐富環(huán)境干預(yù)，進(jìn)行行為學(xué)、情緒、腦海馬神經(jīng)遞質(zhì)含量及突觸相關(guān)蛋白表達(dá)情況測(cè)定，分析其效果。
　　結(jié)果：1)模

4、型組母鼠體重與對(duì)照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，模型組大鼠體重增高率低于對(duì)照組；模型組母鼠皮質(zhì)酮與對(duì)照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，模型組母鼠皮質(zhì)酮水平隨應(yīng)激時(shí)間增長(zhǎng)有大幅度變化；除糞便粒數(shù)外，模型組母鼠行為學(xué)各指標(biāo)與對(duì)照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)，母鼠各行為學(xué)指標(biāo)變化與應(yīng)激時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)系，時(shí)間與應(yīng)激因素之間不存在交互關(guān)系(P均>0.05)；模型組母鼠純水消耗與對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而兩組糖水消耗、總液體消耗和1％

5、蔗糖偏愛(ài)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)，表明應(yīng)激對(duì)孕期大鼠液體消耗指標(biāo)有影響；時(shí)間因素有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，母鼠液體消耗變化與應(yīng)激時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)系；每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的比較：正常對(duì)照組和模型組的基線(xiàn)總液體消耗、糖水消耗、純水消耗、糖水偏愛(ài)百分比差異不大，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。應(yīng)激第7、14天和21天，模型組大鼠液體消耗各指標(biāo)與對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組所產(chǎn)子鼠只數(shù)及孕天數(shù)與對(duì)照組差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<

6、0.05)，模型子鼠組只數(shù)及孕天數(shù)均低于對(duì)照子鼠組；2)在PND28和PND42時(shí)，模型子鼠組體重與對(duì)照子鼠組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型子鼠組血漿皮質(zhì)酮與對(duì)照子鼠組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：模型子鼠組在水迷宮中逃避潛伏期與對(duì)照子鼠組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，時(shí)間因素有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，時(shí)間與應(yīng)激因素之間不存在交互關(guān)系(P>0.05)，模型子鼠組逃避潛伏期時(shí)間比對(duì)照子

7、鼠組長(zhǎng)，且有隨時(shí)間縮短的趨勢(shì)；跨平臺(tái)次數(shù)兩組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；Y迷宮實(shí)驗(yàn)：模型子鼠組在 Y迷宮試驗(yàn)中學(xué)會(huì)所需的訓(xùn)練次數(shù)、記憶保持測(cè)試正確反應(yīng)率與對(duì)照子鼠組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)；行為學(xué)實(shí)驗(yàn)：除清潔次數(shù)外，模型子鼠組行為學(xué)各指標(biāo)與對(duì)照子鼠組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；液體消耗情況：模型子鼠組與對(duì)照子鼠組在液體消耗實(shí)驗(yàn)中糖水消耗和1%蔗糖偏愛(ài)百分比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而在純水消耗和總液體消耗方

8、面未發(fā)現(xiàn)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。懸尾實(shí)驗(yàn)：模型子鼠組與對(duì)照子鼠組在懸尾實(shí)驗(yàn)中靜止時(shí)間和掙扎次數(shù)均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；3)子鼠腦海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，超微結(jié)構(gòu)異常；模型子鼠組與對(duì)照子鼠組海馬膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)ACh含量、ChAT和AChE活性均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，模型子鼠組ACh含量、ChAT活性下降，AChE活性上升；模型子鼠組與對(duì)照子鼠組海馬單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA和5-HT均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，模

9、型子鼠組三個(gè)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)均下降；模型子鼠組與對(duì)照子鼠組海馬的Glu和GABA均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，模型子鼠組較對(duì)照子鼠組興奮性神經(jīng)遞質(zhì) Glu降低、而抑制性GABA含量升高；模型子鼠組與對(duì)照子鼠組海馬的NO存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，模型子鼠組NO含量降低；4) RT-PCR提示：模型子鼠組與對(duì)照子鼠組海馬組織的BDNF mRNA、IGF-ⅡmRNA和NF-?B mRNA差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型子鼠組

10、BDNF mRNA、IGF-ⅡmRNA和NF-?B mRNA表達(dá)降低，Arc mRNA差異未發(fā)現(xiàn)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Western Blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：模型子鼠組與對(duì)照子鼠組海馬組織的BDNF、IGF-Ⅱ、Arc和NF-?B蛋白表達(dá)差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與對(duì)照子鼠組相比，模型子鼠組BDNF、IGF-Ⅱ、Arc和NF-?B表達(dá)降低；5)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：子鼠在水迷宮中的逃避潛伏期和Y迷宮中的訓(xùn)練次數(shù)與母鼠皮

11、質(zhì)酮存在正相關(guān)(P<0.05)、與母鼠水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)和1%蔗糖偏愛(ài)存在負(fù)相關(guān)(P<0.05)；子鼠在水迷宮中的跨平臺(tái)次數(shù)和Y迷宮中的正確反應(yīng)率與母鼠皮質(zhì)酮存在負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)和1%蔗糖偏愛(ài)存在負(fù)相關(guān)(P<0.05)；子鼠在水迷宮中的逃避潛伏期和Y迷宮中的訓(xùn)練次數(shù)與子鼠皮質(zhì)酮、海馬中GABA存在正相關(guān)(P<0.05)、與子鼠ACh、ChAT、NE、DA、5-HT和NO存在負(fù)相關(guān)(P<0.05)；子鼠在水迷宮

12、中的跨平臺(tái)次數(shù)和Y迷宮中的正確反應(yīng)率與子鼠皮質(zhì)酮、海馬中GABA存在負(fù)相關(guān)(P<0.05)、與子鼠ACh、ChAT、NE、DA、5-HT和NO存在正相關(guān)(P<0.05)；除水迷宮中的跨平臺(tái)次數(shù)和Y迷宮中訓(xùn)練次數(shù)與IGF-Ⅱ蛋白表達(dá)未發(fā)現(xiàn)存在相關(guān)外(P>0.05)，其他指標(biāo)均發(fā)現(xiàn)存在相關(guān)性：子鼠在水迷宮中的逃避潛伏期和Y迷宮中的訓(xùn)練次數(shù)均與突觸各相關(guān)蛋白存在負(fù)相關(guān)性(P<0.05)；子鼠在水迷宮中的跨平臺(tái)次數(shù)和Y迷宮中的正確反應(yīng)率與突觸各

13、相關(guān)蛋白存在負(fù)相關(guān)性(P<0.05)；6)豐富環(huán)境對(duì)子鼠體重的影響：模型子鼠組和模型&豐富環(huán)境組體重低于對(duì)照和對(duì)照&豐富環(huán)境組子鼠體重。經(jīng)歷了豐富環(huán)境后，四組體重存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；豐富環(huán)境對(duì)子鼠血漿皮質(zhì)酮水平影響：四組血漿皮質(zhì)酮同樣存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，模型子鼠組分別與其他各組差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對(duì)照&豐富環(huán)境組子鼠血漿皮質(zhì)酮最低，而模型子鼠組是最高的；7)豐富環(huán)境下子鼠學(xué)習(xí)記憶能力變化：四組在M

14、orris水迷宮中逃避潛伏期與對(duì)照子鼠組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩豐富環(huán)境組逃避潛伏期增長(zhǎng)，跨平臺(tái)次數(shù)四組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，對(duì)照&豐富環(huán)境組子鼠跨平臺(tái)次數(shù)最多，而模型子鼠組是最少；四組子鼠在Y迷宮試驗(yàn)中學(xué)習(xí)、記憶次數(shù)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，進(jìn)行豐富環(huán)境，學(xué)習(xí)、記憶能力就會(huì)有所提高；四組子鼠在水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)方面比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)，進(jìn)行豐富環(huán)境，水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)能力就會(huì)有

15、所提高；四組子鼠在純水消耗、糖水消耗和1%蔗糖偏愛(ài)百分比比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，進(jìn)行豐富環(huán)境，糖水消耗就會(huì)有所增加；四組在靜止時(shí)間和掙扎次數(shù)上比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)，模型子鼠組水平靜止時(shí)間最長(zhǎng)、掙扎次數(shù)最少，而模型子鼠組只要進(jìn)行了豐富環(huán)境，靜止時(shí)間就會(huì)縮短、掙扎次數(shù)增多；8)豐富環(huán)境對(duì)各組子鼠神經(jīng)遞質(zhì)影響：四組子鼠在海馬組織膽堿能神經(jīng)遞質(zhì) ACh含量、ChAT和AChE活性，單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA和5-

16、HT含量及氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)Glu和GABA含量均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，豐富環(huán)境對(duì)其均有影響；四組子鼠在海馬組織NO含量方面均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，豐富環(huán)境后，NO含量升高；9)豐富環(huán)境對(duì)蛋白表達(dá)影響：四組子鼠海馬組織的BDNF mRNA、IGF-ⅡmRNA和NF-?B mRNA及蛋白表達(dá)差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，經(jīng)過(guò)豐富環(huán)境后，蛋白表達(dá)增高。
　　結(jié)論：1)孕期應(yīng)激可誘發(fā)實(shí)驗(yàn)?zāi)甘笮袨椤⒒顒?dòng)習(xí)性和生育

17、能力有影響；2)孕期慢性應(yīng)激致子鼠出現(xiàn)高應(yīng)激狀態(tài)，空間、工作學(xué)習(xí)記憶能力下降，情緒出現(xiàn)類(lèi)似焦慮、抑郁現(xiàn)象；3)孕期慢性應(yīng)激影響子鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降與母體及子代血漿中皮質(zhì)酮升高均有關(guān)；4)孕期慢性應(yīng)激對(duì)子鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降與海馬組織中樞神經(jīng)遞質(zhì)變化及BDNF、IGF-Ⅱ、Arc和NF-?B蛋白表達(dá)降低有關(guān)；5)豐富環(huán)境能改善子鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，使大鼠的活動(dòng)度增高、對(duì)新環(huán)境的探究行為和適應(yīng)能力增高、大鼠快感也有所增加；6)豐富環(huán)境提高孕期慢