氟西汀對野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠P-選擇素表達(dá)的影響.pdf

1、P-選擇素(P-selectin)是存在于內(nèi)皮細(xì)胞Weibel-Palade體和血小板a囊泡中的糖蛋白，細(xì)胞激活時迅速轉(zhuǎn)移到膜上。促血栓形成狀態(tài)可源于血液中高濃度的可溶性P-選擇素。抑制P-選擇素可以抑制血小板聚集，抑制P-選擇素還可以抑制血栓形成。血栓形成是肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PH)時的主要表現(xiàn)，而P-選擇素與肺動脈高壓關(guān)系的研究報道很少。已有研究表明在原發(fā)性肺動脈高壓(primary pulmo

2、nary hypertension，PPH)時血漿P-選擇素濃度增加，說明它可能在肺動脈高壓的發(fā)生過程中起到一定的作用，但是在野百合堿性肺動脈高壓中是否有變化還未研究過。野百合堿(monocrotaline，MCT)誘導(dǎo)的肺動脈高壓是一種慢性炎癥性肺動脈高壓模型，許多生物活性因子參與了肺動脈高壓的病理過程，如內(nèi)皮素(endothelin)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、血管緊張素Ⅱ(angiotensi

3、n Ⅱ)等。有研究表明，野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠血漿中5-HT濃度升高，肺動脈平滑肌細(xì)胞5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(5-hydroxytryptamine transporter，5-HTT)mRNA表達(dá)增多，應(yīng)用5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑氟西汀(fluoxetine，F(xiàn)LU)對低氧性肺動脈高壓有一定的保護(hù)作用。氟西汀已被多次報道可以引起出血，而有抑制血栓形成的傾向，推測可能是由于抑制血小板聚集所致。而P-selectin是血小板激活的標(biāo)志，那么

4、氟西汀能抑制P-選擇素的表達(dá)嗎?本研究擬在MCT誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠和經(jīng)氟西汀治療的大鼠模型中，用ELISA．法測定血漿中的P-selectin濃度，用Western blot測定肺組織中的P-selectin，以探討其在肺動脈高壓形成中的可能機(jī)制及其與5-HT的關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)材料和方法: 1．FLU對慢性炎癥性肺動脈高壓大鼠的作用雄性Wistar大鼠28只，隨機(jī)分為四組，對照組、MCT組、氟西汀高劑量組、氟西汀低劑量組。

5、MCT組和氟西汀組一次性腹腔注射MCT60mg/kg。對照組注射同等量的溶劑。氟西汀高劑量組和低劑量組分別給予每天10mg/kg和2mg/kg氟西汀灌胃，對照組和MCT組用相同體積生理鹽水每天灌胃一次。以上各組均常規(guī)飼養(yǎng)21天。 用20％烏拉坦(5mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。剝離右頸動靜脈，將微導(dǎo)管(PE-50)插入右頸動脈，將另一個微導(dǎo)管(PV-1)經(jīng)右頸靜脈插入右心室，經(jīng)血液沖入肺動脈，并通過P23ID壓力換能器連接多導(dǎo)生

6、理記錄儀 (日本光電)測量并記錄肺動脈壓。開胸取出大鼠心臟，分離右心室(RV)、室中隔和左心室(LV+S)，濾紙吸水后稱重，計(jì)算右心室肥大指數(shù)：RV/LV+S。 2．HE染色 將5 μm厚的大鼠肺動脈石蠟切片用HE(Hematoxylin and Eosin)染色，光學(xué)顯微鏡檢測，測量外徑在70-100 μm的肺肌型小動脈中膜厚度，對肺肌型小動脈中膜厚度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 3．ELISA每只大鼠各取1.8ml血，用

7、2％乙二胺四乙酸(EDTA)溶液0.2ml抗凝，3500rpm離心10分鐘，取上層血漿按試劑盒說明檢測P．選擇素的濃度。 4．Western blot取肺組織約100mg，剪碎，加入0.5ml蛋白裂解液，電動勻漿至無組織塊殘留。4℃離心，2000rpm，1min，取上清冰上孵育5min；4℃離心，5000rpm，10min。取上清，即為蛋白提取液。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品，用Bradford法測蛋白濃度，將樣品煮沸5min后進(jìn)行SDS-

8、PAGE蛋白電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，4℃封閉(5％脫脂牛奶)過夜；加一抗P-selectin(1：800稀釋)，水平搖床搖動2小時，PBS-T洗膜3次，每次10分鐘；加二抗P-selectin(1：3000稀釋)，水平搖床搖動1小時，PBS-T洗膜3次，每次10分鐘；ECL試劑盒中A、B試劑1：1混合均勻加于膜上，移入暗室，曝光30秒，顯影5分鐘，定影5分鐘，水洗，晾干，將膠片上的圖像輸入Alphalmager<'TM>2002圖像分析

9、系統(tǒng)，應(yīng)用ID Image Analysis Software進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度測定，結(jié)果以IOD(Integral optical density)值表示。保存結(jié)果并進(jìn)行半定量分析。 5．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析對組間差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，P<0.05時被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果: 三周后，MCT組大鼠肺動脈壓顯著升高(MCT 26.1±4.4，n=7 vs Vehicle 15.9±2.

10、0，n=7 P<0.05)，右心肥大指數(shù)明顯升高(MCT 0.38±0.05，n=7 vs Vehicle 0.22±0.04 n=7 P<0.05)。應(yīng)用FLU處理后的大鼠肺動脈壓顯著降低(FLU2 20.5±3.7，n=7 vs MCT 26.1±4.4，n=7 P<0.05：FLU10 19.2±3.6，n=7 vs MCT 26.1±4.4，n=7P<0.05)；三周后，MCT組大鼠的肺血管平滑肌層明顯比對照組增厚(MCT 0.

11、54±0.05，n=7 vs Vehicle 0.34±0.03，n=7 P<0.05)應(yīng)用FLU處理后的大鼠肺血管平滑肌層增厚減輕(FLU2 0.41±0.07，n=6 vs MCT 0.54±0.05，n=7 P<0.05；FLU100.39±0.02，n=7 vs MCT 0.54±0.05，n=7 P<0.05)；三周后，MCT組大鼠的血漿P-selectin水平顯著升高(MCT 42.8±6.1，n=7 vs Vehicle2

12、7.9±3.9，n=7 P<0.05)，應(yīng)用FLU處理后的大鼠血漿P-selectin水平降低(FLU2 33.9±7.5，n=7 vs MCT42.8±6.1，n=7 P<0.05：FLU10 33.2±1.8，n=7 vs MCT 42.8±6.1，n=7 P<0.05)；三周后，MCT組大鼠的肺組織中P-selectin水平與正常組相比顯著升高(P<0.05)，F(xiàn)LU可明顯降低P-selectin蛋白表達(dá)水平(P<0.05)。