鐵皮石斛miRNA的檢測(cè)及差異表達(dá)研究.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一種長(zhǎng)度約為22nt的內(nèi)源非編碼RNA，miRNA能夠與靶mRNA互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)而切割或抑制靶基因，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。成熟的miRNA與AGO蛋白結(jié)合形成RISC復(fù)合體進(jìn)而與靶mRNA的非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對(duì)最終下調(diào)靶基因的表達(dá)量。越來(lái)越多的研究表明，miRNA參與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、增殖分化以及凋亡等眾多生物學(xué)過(guò)程。
　　隨著植物miRNA研究不斷推進(jìn)，已有包括擬南芥、水稻、玉米、大豆等在內(nèi)的眾多植物m

2、iRNA被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道。miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)收入了大量的植物miRNA信息供科研人員查詢和研究。然而目前在miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中未見(jiàn)有鐵皮石斛miRNA被收錄。因此，檢測(cè)鐵皮石斛miRNA將成為研究鐵皮石斛miRNA的生物學(xué)功能的關(guān)鍵。
　　鐵皮石斛是多年生單子葉蘭科植物，在中國(guó)是一種傳統(tǒng)名貴中草藥材，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞、促消化、降血壓以及抗腫瘤等多種藥用功效。在自然環(huán)境下鐵皮石斛存活率很低，再加上近年來(lái)過(guò)度采挖，野生鐵皮

3、石斛資源幾近枯竭。目前市場(chǎng)上的鐵皮石斛主要來(lái)自于人工栽培。在自然環(huán)境或人工栽培條件下，鐵皮石斛的生長(zhǎng)十分緩慢，并且必須與真菌共生才能存活；而在組織培養(yǎng)環(huán)境中，鐵皮石斛無(wú)菌苗中不含有共生菌，但需要在培養(yǎng)基中添加激素才能生長(zhǎng)，這表明了培養(yǎng)基中的激素可能對(duì)鐵皮石斛的生長(zhǎng)發(fā)育起到關(guān)鍵作用。為檢測(cè)鐵皮石斛中所含有的miRNA以及探索組培和盆栽環(huán)境下鐵皮石斛miRNA表達(dá)差異，我們采用miRNA芯片來(lái)檢測(cè)鐵皮石斛的miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了120個(gè)在組

4、培鐵皮石斛和盆栽鐵皮石斛中均表達(dá)的miRNA，它們分別來(lái)自于37個(gè)miRNA家族。通過(guò)與其他植物發(fā)現(xiàn)的miRNA相比較，我們發(fā)現(xiàn)這些miRNA與水稻及擬南芥等植物的miRNA有著很高的同源性，說(shuō)明在許多植物中這些miRNA具有較高的進(jìn)化保守性。
　　基于兩組芯片實(shí)驗(yàn)信號(hào)值，我們篩選出在組培和盆栽鐵皮石斛中差異表達(dá)的6個(gè)miRNA家族的45條miRNA。結(jié)果顯示，與盆栽鐵皮石斛相比，miR156，miR164，miR171，miR5

5、29和miR827在組培鐵皮石斛中高表達(dá)，而miR167在組培鐵皮石斛中低表達(dá)，這說(shuō)明了鐵皮石斛miRNA可以由不同的種植環(huán)境調(diào)控。通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)以及GO注釋，我們發(fā)現(xiàn)大多差異表達(dá)miRNA參與生長(zhǎng)調(diào)控、核酸結(jié)合以及應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程。為了驗(yàn)證部分芯片實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們篩選出6個(gè)具有代表性的miRNA進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示，與盆栽鐵皮石斛表達(dá)的miRNA相比，6條測(cè)試的miRNA中，miR156g、miR529b以及miR82

6、7a在組培鐵皮石斛葉片組織中表達(dá)量上調(diào)，而miR159d、miR167h以及miR528在組培鐵皮石斛葉片組織中表達(dá)量下降。其中miR156g、miR529b和 miR167h在兩組鐵皮石斛中表達(dá)量差異最高，因此它們可能在組培鐵皮石斛的生長(zhǎng)發(fā)育中起到重要作用。此外，miRNA芯片與qRT-PCR兩種方法所產(chǎn)生的表達(dá)差異結(jié)果數(shù)據(jù)總體比較吻合，這說(shuō)明芯片結(jié)果能夠被qRT-PCR實(shí)驗(yàn)所驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了鐵皮石斛miRNA并初步篩選了在組織培養(yǎng)