人真皮多能干細胞分離擴增及真皮再生模板的構(gòu)建研究.pdf

1、解決大面積深度燒傷創(chuàng)面快速、永久性覆蓋問題以及如何促進慢性創(chuàng)面愈合，從而減輕傷員的痛苦、提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量和降低社會醫(yī)療負擔等方面有著重要的現(xiàn)實意義。近二十年來，皮膚組織工程和干細胞的研究進展為創(chuàng)面的修復提供了新思路。但是，目前研制的組織工程皮膚不但價格昂貴，而且功能缺陷，不能實現(xiàn)皮膚完美修復。人們發(fā)現(xiàn)，真皮重建能提高創(chuàng)面的愈合質(zhì)量，要實現(xiàn)組織工程皮膚的完美修復，首先從構(gòu)建功能完備的真皮入手。真皮組織結(jié)構(gòu)復雜，必須選擇增殖、分化潛能旺盛的

2、干細胞為種子細胞來重建真皮。組織中的干細胞數(shù)量少，干細胞的特性難以維持。因此選擇何種干細胞以及如何簡便快捷地獲取足夠用量的干細胞是皮膚組織工程重要研究方向之一。本課題研究不同年齡組人真皮多能干細胞的分離方法及體外分化特點；依據(jù)干細胞克隆增殖潛能、多向分化、不易老化的生理特性進行鑒定；探索干細胞特別是老年人皮膚來源的多能干細胞的體外擴增方法；在此基礎(chǔ)上，以人血漿為支架，以真皮多能干細胞為種子細胞，構(gòu)建真皮再生模板，觀察其對全層皮膚缺損創(chuàng)面

3、愈合的影響；為以后選擇合適的種子細胞構(gòu)建組織工程皮膚或自體細胞移植用于創(chuàng)面修復提供理論依據(jù)和方法。 第一部分.不同年齡組人真皮多能干細胞的分離、鑒定及體外分化特點 [目的]研究不同年齡組人真皮多能干細胞的分離、鑒定及體外分化特點。[方法]取5例胎兒、5例小兒、6例成年人、6例老年人正常皮膚標本，采用限制性干細胞培養(yǎng)基篩選克隆并記錄克隆的數(shù)量和大小；檢測不同年齡供體克隆細胞的分子標志物nestin、fibronectin、

4、c-Myc、STAT3、TERT、E-Cadherin、Vimentin及PCK蛋白和體外分化情況并定量；篩選的克隆細胞進行單克隆分析；克隆細胞植入裸鼠皮下，觀察有無致瘤性。[結(jié)果](1)胎兒、小兒、成年人、老年人1cm2皮膚原代培養(yǎng)獲得的懸浮克隆個數(shù)分別為(20.1±2.5)×102、(15.8±5.7)×102、(10.8±1.29)×102、(6.25±1.37)×102；胎兒＞小兒＞成年人＞老年人。原代克隆直徑分別為(83.33

5、±12.11)μm、(55.45±10.11)μm、(45.71±11.70)μm、(42.14±8.09)μm；胎兒＞小兒＞成年人、老年人。(2)各組克隆細胞均能向神經(jīng)元細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、平滑肌細胞和脂肪細胞分化；定量分析發(fā)現(xiàn)胎兒、小兒和成年人、老年人克隆細胞分別向神經(jīng)元細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、脂肪細胞優(yōu)勢分化。(3)上述懸浮克隆的單個細胞具有克隆形成能力；單克隆增殖細胞亦能多向分化。(4)免疫熒光細胞化學檢測發(fā)現(xiàn)，克隆團明顯表達nes

6、tin、fibronectin、c-Myc、STAT3及TERT蛋白。流式細胞分析術(shù)發(fā)現(xiàn)98.5±1％的克隆形成細胞表達nestin及95.2±1.3％的細胞表達fibronectin；克隆形成細胞不表達E-Cadherin、Vimentin、NSE、GFAP及PCK蛋白。(5)細胞活體植入無致瘤性。[結(jié)論]不同年齡組人真皮中具有克隆增殖和多向分化的干細胞采用限制性干細胞培養(yǎng)基能夠有效分離；年齡對人真皮多能干細胞的數(shù)量、增殖、分化有影響

7、。 第二部分.老年人真皮多能干細胞的體外有效擴增 [目的]探討老年人真皮多能干細胞體外有效擴增方法。[方法]取6例老年人皮膚標本，胰酶消化，采用限制性干細胞培養(yǎng)基和含血清的培養(yǎng)液交替培養(yǎng)進行克隆篩選和擴增傳代；利用免疫細胞化學技術(shù)、克隆分析、細胞5-溴脫氧尿嘧啶摻入來評價擴增細胞的生理特性。[結(jié)果](1)1cm2大的老年人皮膚原代獲得400-600個細胞克隆；有效擴增后可獲得(2-3)×105個細胞克隆/代。(2)克隆細

8、胞體外可向神經(jīng)細胞、膠質(zhì)細胞、平滑肌細胞和脂肪細胞分化；單細胞克隆形成率約20％，也能向上述細胞分化；克隆細胞的細胞核摻入5-溴脫氧尿嘧啶。(3)細胞克隆明顯表達nestin、fibronectin、c-Myc、STAT3及TERT蛋白。流式細胞分析術(shù)發(fā)現(xiàn)，克隆形成細胞不表達E-Cadherin、Vimentin、NSE、GFAP及PCK蛋白。[結(jié)論]限制性干細胞培養(yǎng)基和含血清的培養(yǎng)液交替培養(yǎng)是老年人皮膚多能干細胞分離和擴增的有效方法；

9、擴增的細胞仍維持原代的特性。 第三部分.真皮多能干細胞復合血漿構(gòu)建真皮再生模板及移植觀察 [目的]以人真皮多能干細胞為種子細胞構(gòu)建真皮再生模板，觀察移植后成活狀態(tài)。[方法]5-BrdU標記的真皮多能干細胞接種0型血漿中構(gòu)建真皮模板并作組織學觀察；裸鼠背部制作全層皮膚缺損創(chuàng)面，真皮模板移植后3、6、9天取材觀察血管化程度；創(chuàng)面上皮化后第1、3周取材，免疫組織化學檢測模板中標記細胞的成活狀態(tài)。[結(jié)果](1)干細胞在血漿中增殖

10、良好；真皮模板為白色生物膜，厚約(500±254)μm。(2)真皮模板中部分細胞仍表達nestin；(3)真皮模板植入后第3天，模板下有少量的血管生成；第9天大量細胞遷入模板中。(4)創(chuàng)面上皮化后第1、3周，皮膚組織的表皮和真皮中可見大量的5-BrdU陽性細胞分布。[結(jié)論]真皮多能干細胞接種于血漿中構(gòu)建的真皮模板移植后能較快的血管化；真皮模板細胞在受體組織中能成活下來。 第四部分.真皮再生模板對全層皮膚缺損創(chuàng)面愈合的影響

11、 [目的]觀察真皮再生模板對皮膚創(chuàng)面愈合質(zhì)量的影響。[方法]分離培養(yǎng)鼠的真皮多能干細胞；以血漿為載體構(gòu)建真皮再生模板；60只裸鼠背部制作皮膚缺損創(chuàng)面，隨機平分為真皮模板移植組(A組)、單純血漿支架組移植(B組)和空白組(C組)，記錄創(chuàng)面愈合時間；創(chuàng)面愈合后第2天，用透明膜描繪法估計創(chuàng)面的攣縮程度；創(chuàng)面愈合后第1周取材，測量皮膚的機械性能；HE染色，光鏡下測量表皮的厚度；分別在創(chuàng)面愈合后第1、2、4、8周取材進行組織學觀察；免疫熒光檢測表

12、皮下及真皮層PGP9.5的表達，以此反映皮膚神經(jīng)再生情況。[結(jié)果](1)A組、B組、C組創(chuàng)面愈合時間分別為(15.7±1.0)d、(19.7±1.44)d、(20.5±1.2)d；A組愈合時間早于后兩組(p＜0.05)。(2)A組、B組、C組創(chuàng)面攣縮的百分率分別為(39.45±4.40)％、(41.63±3.7)％、(51.81±2.67)％，A、B兩組創(chuàng)面攣縮的百分率小于C組(P＜0.05)；A組創(chuàng)面攣縮的百分率小于B兩，但無統(tǒng)計學差

13、異(P＞0.05)。(3)A組、B組、C組創(chuàng)面愈合1周后表皮厚度分別為(1051.8±108.1)μm、(801.28±34.34)μm、(510.16±92.98)μm；A組表皮明顯厚于B、C兩組(P＜0.01)；B組表皮厚于C組(p＜0.05)(4)A組、B組、C組創(chuàng)面愈合后1周皮膚的最大中斷拉力分別為(13.87±0.38)N、(11.86±0.57)N、(7.37±0.82)N；A組中斷拉力大于后兩組(P＜0.05及0.01)；

14、B組大于C組(P＜0.01)。三組皮膚拉斷時所延伸的長度分別為(12.71±1.81)mm、(11.71±1.23)mm、(5.69±0.61)mm，A、B兩組延伸的長度大于C組(P＜0.01)；A、B兩組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。(5)A組創(chuàng)面愈合后第1、2周表皮下及真皮層PGP9.5熒光密度高于B組、C組(p＜0.01)；B組第2周真皮層和第4周表皮下PGP9.5熒光密度高于C組。(6)創(chuàng)面愈合后第8周，A組新生上皮有少量的短小