骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植誘導(dǎo)分化及對(duì)肝功能影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone mesenchymal stem cell，BMSCs）具有極強(qiáng)的自我復(fù)制和多向分化潛能，來源廣泛，易于獲取并且具有低免疫源性，可將BMSCs用于細(xì)胞移植治療，具有非常重要的理論研究意義和臨床價(jià)值。近年來的研究提示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞，這一現(xiàn)象為臨床上應(yīng)用BMSCs移植治療肝損傷和急慢性肝功能衰竭展示了一個(gè)可喜的前景?，F(xiàn)已證實(shí)，在體外培養(yǎng)條件下BMSCs可由肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte

2、growth factor，HGF）等細(xì)胞因子誘導(dǎo)向肝細(xì)胞分化，并可釋放多種肝細(xì)胞因子，但對(duì)BMSCs體內(nèi)移植后能否向具肝細(xì)胞功能的細(xì)胞分化并對(duì)受損肝臟起修復(fù)作用的研究則鮮見報(bào)道。因此，本課題將大鼠骨髓中分離獲得的BMSCs在體外純化、擴(kuò)增后通過門靜脈移植入肝損傷大鼠體內(nèi)，觀察BMSCs移植后在肝臟內(nèi)的分布及受損肝臟修復(fù)情況，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與簽定。 目的:建立大鼠骨髓間

3、充質(zhì)干細(xì)胞分離和培養(yǎng)擴(kuò)增的方法，同時(shí)對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為BMSCs作為種子細(xì)胞治療臨床疾病提供理論依據(jù)。 方法:聯(lián)合應(yīng)用密度梯度離心法和貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行分離獲取大鼠BMSCs，應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面標(biāo)記物來鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞是否為BMSCs；在倒置顯微鏡下觀察BMSCs的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定BMSCs接種貼壁率，并繪制出生長(zhǎng)曲線。 結(jié)果:通過聯(lián)合密度梯度離心法與貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方法分離培養(yǎng)出的BMSCs純度高。

4、BMSCs體外培養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛，具有活躍的增殖能力。培養(yǎng)的BMSCs陽性表達(dá)CD29、CD44，陰性表達(dá)CD34、CD45。 結(jié)論:通過聯(lián)合密度梯度離心與貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方法能從骨髓中獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；獲得的BMSCs在體外生長(zhǎng)穩(wěn)定，且增殖較快，可作為組織工程的種子細(xì)胞。 第二部分慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞研究。 目的:對(duì)分離、培養(yǎng)到第三代的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染，觀察其轉(zhuǎn)染效率及對(duì)骨髓間

5、充質(zhì)干細(xì)胞生物活性的影響，為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基因治療研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法:利用密度梯度離心、貼壁篩選法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。利用脂質(zhì)體法進(jìn)行慢病毒感染大鼠BMSCs。 結(jié)果:體外分離培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）的慢病毒轉(zhuǎn)染72h后可見綠色熒光蛋白的表達(dá)，96h后達(dá)到高峰。轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外繼續(xù)培養(yǎng)，1月后仍可見綠色熒光蛋白

6、的表達(dá)，但表達(dá)強(qiáng)度較前減弱。在一定病毒復(fù)數(shù)范圍內(nèi)，慢病毒對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率隨病毒復(fù)數(shù)的增加而增高，當(dāng)病毒復(fù)數(shù)為5時(shí)，轉(zhuǎn)染率達(dá)到80%以上；但病毒復(fù)數(shù)超出一定范圍后，轉(zhuǎn)染率反而下降。慢病毒轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和未轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線未見明顯變化。 結(jié)論:慢病毒對(duì)大鼠BMSCs有較高的轉(zhuǎn)染率，且攜帶的GFP能在BMSCs內(nèi)有效表達(dá)，可以作為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基因治療的載體和體內(nèi)示蹤。 第三部分骨髓

7、間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)肝功能影響的實(shí)驗(yàn)研究。 目的:觀察同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植在肝臟特定微環(huán)境下是否向具肝細(xì)胞功能的細(xì)胞分化并探討其對(duì)大鼠受損肝臟修復(fù)作用的可行性。 方法:利用密度梯度離心、貼壁篩選法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后的第3代BMSCs從門靜脈植入肝大部分切除大鼠體內(nèi)，分別于移植后7、14、28d行血清肝功能檢測(cè)，分析BMSCs對(duì)肝功能的作用。移植后的第28d取出肝臟，通過冰凍切片熒光檢測(cè)，觀

8、察BMSCs在大鼠肝臟內(nèi)定居分布情況。 結(jié)果:大鼠連續(xù)用2-乙酰氨基芴（2-acetylaminofluorene，2-AAF）灌喂6d后出現(xiàn)精神萎靡、厭食、少活動(dòng)、尿深黃；肉眼見肝臟明顯充血腫大、邊緣圓鈍、表面可見針尖樣細(xì)小顆粒、呈局灶性，偶見有小出血點(diǎn)；HE見部分肝細(xì)胞腫脹、胞質(zhì)疏松。術(shù)后BMSCs移植組和DMEM/F12注射組各肝功能檢測(cè)指標(biāo)均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸恢復(fù)；BMSCs移植組與DMEM/F12注射組比較，ALB、A

9、LT和AST均有顯著性差異（P<0.05）。術(shù)后28d，BMSCs移植組與正常組比較，ALB、ALT、AST、ALP均無顯著性差異（P>0.05）； DMEM/F12注射與正常組比較，ALB、ALT均有顯著性差異（P<0.05）。這些表明BMSCs移植對(duì)肝功能的恢復(fù)有促進(jìn)作用。術(shù)后冰凍切片，BMSCs移植組可見BMSCs定居于肝臟內(nèi)，主要在匯管區(qū)周圍，肝實(shí)質(zhì)里也可見散在分布，而心、肺、脾、腎未見BMSCs。HE染色BMSCs移植組肝小葉