針對(duì)HBV S基因的反義鎖核酸抗乙肝病毒表達(dá)的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：以HepG2．2．15細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究?yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的針對(duì)HBV S基因反義鎖核苷酸片段抗乙肝病毒的療效，為研究和開(kāi)發(fā)新型抗乙肝藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1、HepG2．2．15細(xì)胞的鑒定：分別用PCR、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)HepG2．2．15 HBV亞型、活性及功能進(jìn)行鑒定。 2、篩選陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑量及初步確定HepG2．2．15細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率：分別用2．5、5、7．5

2、和10μL/mL脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HepG2．2．15細(xì)胞；觀察其分泌HBsAg、HBeAg量；并用MTT法檢測(cè)脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞的毒性；及凋亡染色試劑檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。用上述四個(gè)濃度的陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹pEGFP-N1轉(zhuǎn)染HepG2．2．15細(xì)胞48h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白的量，以確定細(xì)胞是否易感及轉(zhuǎn)染效率的高低。 3、ASODN的設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)并合成互補(bǔ)于HBV mRNA S基因翻譯起始位點(diǎn)（155～165nt）的11聚反義寡

3、脫氧核苷酸（ASODN），分別進(jìn)行LNA修飾、磷酸全硫代修飾，同時(shí)設(shè)計(jì)合成與HBV基因的無(wú)關(guān)序列作為對(duì)照。 4、進(jìn)一步篩選ASODN/陽(yáng)離子脂質(zhì)體的比例：以5和7．5μL/mL脂質(zhì)體包裹PSODN觀察其分泌HBsAg、HBeAg量；并用MTT法檢測(cè)PSODN/脂質(zhì)體復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的毒性；凋亡染色試劑檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。 5、檢測(cè)LNA體外抗核酶的穩(wěn)定性：用核酸外酶切對(duì)LNA、脂質(zhì)體包裹的LNA、PSODN和脂質(zhì)體包裹的PSO

4、DN進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳后觀察結(jié)果，判斷修飾后的ASODN及脂質(zhì)體包裹后ASODN體外抗酶切的穩(wěn)定性。 6、LNA體外抗HBV活性：將脂質(zhì)體包裹LNA、未修飾ASODN、無(wú)關(guān)ODN及脂質(zhì)體對(duì)照、拉米夫定及空白對(duì)照分別作用HepG2．2．15細(xì)胞。每隔48h收集細(xì)胞上清，連續(xù)10滅檢測(cè)其分泌HBsAg、HBeAg量及熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBV DNA含量的變化。并用MTT法檢測(cè)LNA/脂質(zhì)體復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的毒性

5、；及凋亡染色試劑檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果： 1、培養(yǎng)HepG2．2．15細(xì)胞上清中含乙肝病毒DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增結(jié)果與HBV基因ayw亞型相符，該細(xì)胞能持續(xù)分泌HBsAg、HBeAg及病毒顆粒，免疫組化HBsAg呈陽(yáng)性。 2、陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HepG2．2．15細(xì)胞時(shí)濃度宜小于7．5μL/mL，陽(yáng)離子脂質(zhì)體能抑制細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg，對(duì)該細(xì)胞具有一定的毒性作用（與空白對(duì)照組比較P<0．05），能誘導(dǎo)部分

6、細(xì)胞凋亡。HepG2．2．15細(xì)胞對(duì)陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的pEGFP-N1易感，能表達(dá)綠色熒光蛋白，但轉(zhuǎn)染效率較低（<23％）。 3、ASODN與陽(yáng)離子脂質(zhì)體的比例宜為3μ/5μL/mL。若脂質(zhì)體與PSODN濃度過(guò)大，細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg均受抑制，細(xì)胞存活率低，凋亡現(xiàn)象較多見(jiàn)。 4、經(jīng)LNA修飾的ASODN在體外有良好的抗酶切穩(wěn)定性。而PSODN及脂質(zhì)體包裹后PSODN不能抵抗酶切作用。 5、針對(duì)HBV S

7、片段翻譯起始區(qū)的各種修飾的ASODN均具抑制細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg（與空白對(duì)照組比較P<0．05），其中LNA組對(duì)HBsAg、HBeAg的抑制效最高達(dá)67．7％、59．7％，優(yōu)于拉米夫定組。FQ-PCR結(jié)果顯示細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBV DNA均為陽(yáng)性，LNA組抑制HBV DNA達(dá)63．3％（與空白對(duì)照組比較P<0．05）與HBsAg、HBeAg結(jié)果相符。 6、LNA對(duì)HepG2．2．15細(xì)胞毒性作用較小，與脂質(zhì)體對(duì)照組無(wú)明顯

8、差異。LNA能誘導(dǎo)HepG2．2．15細(xì)胞凋亡。 結(jié)論： 1、HepG2．2．15細(xì)胞具有良好的HBV表達(dá)活性，為篩選抗HBV藥物的良好體外模型。 2、陽(yáng)離子脂質(zhì)體抑制HepG2．2．15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg，對(duì)細(xì)胞有一定的毒性作用，并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。HepG2．2．15細(xì)胞對(duì)陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)染易感。 3、經(jīng)LNA修飾的ASODN有良好的抗酶切作用。 4、針對(duì)HBV S片段翻譯起