流動(dòng)狀態(tài)下ADAMTS13羧基端的功能研究.pdf

1、【目的】研究ADAMTS13 及其重組體蛋白于體外剪切力條件下裂解VWF，降低血小板黏附能力的差異。
　　 【方法】
　　 (1)將ADAMTS13 及其重組體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化擴(kuò)增，并大量提取，同時(shí)雙酶切瓊脂糖凝膠電泳鑒定各質(zhì)粒。
　　 (2)將已擴(kuò)增并鑒定正確的ADAMTS13 及其重組體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入COS7細(xì)胞，收集瞬時(shí)表達(dá)ADAMTS13 及其重組體蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過超濾管獲得初步純化的重組蛋白，Western

2、-Blot 檢測(cè)各瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞分泌的蛋白。
　　 (3)利用流體力學(xué)裝置Flow-Chamber（平板流動(dòng)小室）培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，并通過蠕動(dòng)泵加壓流動(dòng)培養(yǎng)基模擬人體血管內(nèi)流動(dòng)狀態(tài)，檢測(cè)ADAMTS13 及其重組體蛋白對(duì)于損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌的UL-VWF的裂解作用以及下調(diào)血小板黏附、延緩血栓形成的能力差異。
　　 【結(jié)果】
　　 (1)成功在真核表達(dá)細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)ADAMTS13 及其重組體蛋白，通過簡(jiǎn)

3、單純化各種表達(dá)蛋白，Western-Blot 證實(shí)為正確分子量。
　　 (2)在Flow-Chamber模擬人體血管內(nèi)剪切力作用下，全長(zhǎng)FL（Full length）蛋白和MDTCS（截除羧基端TSP2-8和CUB1+2 片段）蛋白可以不同程度的抑制血小板凝集，delCUB（截除羧基端CUB1+2 片段）蛋白抑制血小板凝集的能力顯著下降。
　　 【結(jié)論】
　　 (1)成功瞬時(shí)表達(dá)全長(zhǎng)ADAMTS13 及其重組體蛋