WXXW基序?qū)DAMTS13分泌及功能的影響.pdf

1、ADAMTS13，又稱為血管性血友病因子水解蛋白酶（VWF-CP），是存在于血漿中的金屬蛋白酶，隸屬于ADAMTSs（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs）金屬蛋白酶超家族。人ADAMTS13基因于2001年首次被克隆報(bào)導(dǎo)，定位于9號(hào)染色體長臂端（9q34）?；蛉L37kb，主要由29個(gè)外顯子組成，其基因表達(dá)開放閱讀框?yàn)?284bp，編碼1427個(gè)

2、氨基酸。ADAMTS13蛋白主要由9個(gè)結(jié)構(gòu)功能域組成，從氨基端到羧基端依次為：信號(hào)肽、前導(dǎo)肽、金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、去整合素結(jié)構(gòu)域、凝血酶敏感蛋白1（TSP1）第1基序、富半胱氨酸區(qū)域、間隔區(qū)、凝血酶敏感蛋白1（TSP1）第2-8重復(fù)基序、補(bǔ)體結(jié)合區(qū)域（CUB）。ADAMTS13主要通過水解人血管性血友病因子（VWF），降解血漿中超大分子量VWF多聚體，使其對(duì)血小板的黏附與聚集能力降低，從而抑制血栓形成。ADAMTS13酶活性降低與血栓性血

3、小板減少性紫癜（TTP）的發(fā)病密切相關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn)，ADAMTS13金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域識(shí)別并水解VWF蛋白A2區(qū)第1605酪氨酸殘基和1606位蛋氨酸殘基間肽鍵。而ADAMTS13金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域臨近的羧基端結(jié)構(gòu)域，包括去整合素結(jié)構(gòu)域、凝血酶敏感蛋白1（TSP1）第1基序、富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域、間隔區(qū)，確保ADAMTS13對(duì)VWF的正確識(shí)別及有效的水解。
　　本文圍繞ADAMTS13的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行研究，主要包括三個(gè)部分：1）構(gòu)建了

4、ADAMTS13的TSR1結(jié)構(gòu)域中WXXW基序突變體（W387A），觀察其對(duì)ADAMTS13分泌及酶活性的影響；2）構(gòu)建了ADAMTS13-pEGFP-N1綠色熒光真核表達(dá)載體，為研究ADAMTS13細(xì)胞內(nèi)合成及轉(zhuǎn)運(yùn)過程提供有力的研究工具；3）獲得了多株分泌抗ADAMTS13的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，以備進(jìn)一步單克隆抗體分選及功能研究。
　　一、WXXW基序?qū)DAMTS13分泌及功能的影響
　　WXXW基序在凝血酶敏感蛋

5、白1蛋白超家族中普遍存在，其中包括ADAMTSs金屬蛋白酶家族。對(duì)于WXXW基序的研究主要集中在凝血酶敏感蛋白1蛋白上，此基序被認(rèn)為是凝血酶敏感蛋白1蛋白結(jié)合并活化TGF-β（transforming growth factor-β）所必需的。在對(duì)霍亂毒素分泌蛋白EpsM的研究中發(fā)現(xiàn)，WXXW基序中芳香族氨基酸殘基之間的相互作用可能與跨膜蛋白質(zhì)的二聚化有關(guān)。WXXW基序在ADAMTSs金屬蛋白酶家族中普遍存在，然而，其功能尚未可知。為了

6、研究該基序的功能，我們構(gòu)建了WXXW基序的突變體W387A的真核表達(dá)載體。
　　首先，我們用野生型ADAMTS13及W387A突變體的真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集培養(yǎng)上清及細(xì)胞。將濃縮后培養(yǎng)上清及細(xì)胞裂解液行SDS-PAGE電泳及west blot，通過灰度值測定判斷上清及細(xì)胞裂解液中蛋白的含量。用培養(yǎng)上清中蛋白含量除以培養(yǎng)上清及細(xì)胞裂解液中蛋白總量，計(jì)算蛋白的分泌量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：野生型ADAMTS13上

7、清中蛋白含量為72.38%±10.70%，細(xì)胞裂解液中為27.62%±9.56%；而W387A突變體上清中蛋白含量為20.46%±5.85%，細(xì)胞裂解液中為79.54%±5.46%。結(jié)果表明，W387A突變抑制了ADAMTS13的分泌，使得大量的ADAMTS13蛋白積蓄在細(xì)胞內(nèi)。蛋白細(xì)胞內(nèi)定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，野生型蛋白細(xì)胞內(nèi)分布呈指環(huán)狀，而突變體蛋白細(xì)胞內(nèi)分布彌散，提示突變體蛋白更多地滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。
　　其次，我們構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)野

8、生型ADAMTS13及W387A突變體蛋白的HeLa細(xì)胞株，并擴(kuò)大培養(yǎng)，收集無血清培養(yǎng)上清，從而獲得野生型ADAMTS13及W387A突變體蛋白，并進(jìn)一步完成ADAMTS13功能檢測。
　　第三，我們用非變性的人血漿來源VWF（pVWF）及經(jīng)過預(yù)變性處理的pVWF包板，再分別加入野生型ADAMTS13或W387A突變體蛋白進(jìn)行孵育，通過ELISA的方法，測定重組ADAMTS13蛋白與pVWF結(jié)合的量。結(jié)果表明，與野生型ADAMTS

9、13相比，W387A突變體與變性的pVWF結(jié)合能力明顯降低，而與非變性的pVWF的結(jié)合能力與野生型ADAMTS13沒有明顯區(qū)別。
　　第四，我們分別在變性條件下及高剪切力條件下，以pVWF為底物，檢測了野生型ADAMTS13及W387A突變體對(duì)pVWF的水解能力。通過還原條件下的5% SDS-PAGE電泳及western blotting方法，分析176kDa分子量大小的酶切產(chǎn)物生成量，從而判斷重組ADAMTS13酶活性的高低。我

10、們發(fā)現(xiàn)，在變性條件下，加入野生型ADAMTS13的反應(yīng)體系中，176kDa分子量大小的酶切產(chǎn)物生成量明顯多于加入W387A突變體的反應(yīng)體系。此外，在多聚體瓊脂糖凝膠電泳分析中，我們發(fā)現(xiàn)在野生型ADAMTS13酶切體系中，大中分子量VWF多聚體降低水平明顯高于W387A突變體酶切的反應(yīng)體系，進(jìn)一步證實(shí)了在變性條件下，W387A突變體對(duì)VWF的水解能力明顯降低。然而在高剪切力條件下，無論是野生型ADAMTS13酶切體系還是W387A酶切體系

11、，176kDa分子量大小的酶切產(chǎn)物生成量沒有明顯區(qū)別。而多聚體瓊脂糖凝膠電泳分析也顯示，兩個(gè)體系中，大中分子量VWF多聚體減少的量基本一致。
　　第五，我們以以FRETS-VWF73為底物，測定野生型ADAMTS13及W387A突變體水解VWF的活性。以1：25稀釋比例的正常人混合血漿中ADAMTS13活性為100%，計(jì)算重組ADAMTS13活性，結(jié)果以百分?jǐn)?shù)表示。結(jié)果表明，野生型ADAMTS13活性約為97%±6.50%，明顯高

12、于W387A突變體活性（72%±5.50%）。此結(jié)果與變性條件下W387A突變體活性降低結(jié)果一致。
　　二、構(gòu)建ADAMTS13-pEGFP-N1綠色熒光真核表達(dá)載體
　　既往研究表明，ADAMTS13與血栓性血小板減少性紫癜(TTP)的發(fā)病密切相關(guān)，ADAMTS13基因突變?yōu)檫z傳性TTP的基本病因。目前國際上報(bào)道的種ADAMTS13突變類型，絕大多數(shù)為錯(cuò)義突變。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，大部分錯(cuò)義突變似乎都是通過影響蛋白的分泌而導(dǎo)致ADA

13、MTS13缺失。為了進(jìn)一步研究突變對(duì)ADAMTS13蛋白分泌的影響，我們構(gòu)建了ADAMTS13-pEGFP-N1熒光表達(dá)載體，為深入研究ADAMTS13的突變體對(duì)其分泌的影響，以及進(jìn)一步探討ADAMTS13細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程提供有力的研究工具。
　　首先，我們以野生型ADAMTS13通過 PCR的方法獲得目的基因片段，并在目的基因兩端添加兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。將目的基因連接至T載體后擴(kuò)增，酶切后將酶切產(chǎn)物與pEGFP-N1熒光表達(dá)載體

14、連接，獲得ADAMTS13-pEGFP-N1真核表達(dá)載體。
　　其次，我們將該熒光表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，48小時(shí)后收集細(xì)胞上清經(jīng)超濾濃縮后6%SDS-PAGE電泳，以ADAMTS13-His蛋白為陽性對(duì)照western blotting鑒定。并將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞固定、破膜、染核后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示：ADAMTS13-pEGFP蛋白在210 kDa處顯一蛋白條帶，分子量略高于ADAMTS13-His。熒光顯

15、微鏡下觀察所見，轉(zhuǎn)染pSecTag-ADAMTS13-His質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)僅見DAPI藍(lán)色熒光；轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空載體的細(xì)胞可見彌漫勻質(zhì)綠色熒光；轉(zhuǎn)染 ADAMTS13-pEGFP-N1質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)，可見多少不等的綠色熒光。表明帶有綠色熒光標(biāo)簽的ADAMTS13蛋白成功表達(dá)。ADAMTS13-pEGFP-N1真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　三、初步獲得多株分泌抗ADAMTS13的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，以備進(jìn)一步分選及功能研究。<

16、br>　　為了進(jìn)一步方便ADAMTS13結(jié)構(gòu)及功能的研究，并期待能篩選出具有一定功能活性的單克隆抗體，我們初步獲得了多株分泌抗ADAMTS13的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
　　首先，我們構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)截短型ADAMTS13-T7蛋白的HeLa細(xì)胞株，并擴(kuò)大培養(yǎng)，收集無血清培養(yǎng)上清。截短型ADAMTS13-T7的真核表達(dá)載體為pSectag-2A，該載體在蛋白的羧基端添加了6個(gè)組氨酸His標(biāo)簽。通過Ni-NTA Agarose將濃縮

17、后上清純化，然后通過SDS-PAGE電泳后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色和western blot鑒定，以全長ADAMTS13為對(duì)照。結(jié)果顯示，濃縮后上清及純化后蛋白均能在150 kDa左右處顯單一蛋白區(qū)帶。
　　其次，我們用真核表達(dá)的截短型ADAMTS13-T7蛋白采用皮下多點(diǎn)注射免疫8周齡Balb/c雌性小鼠，并用純蛋白液直接經(jīng)尾靜脈注射加強(qiáng)免疫。末次免疫后第3天眼球采血，分離上述小鼠抗血清，用ELISA方法測定免疫小鼠與ADAMTS13

18、-T7蛋白的抗血清效價(jià)。用未免疫的正常小鼠血清作為陰性對(duì)照。用重組ADAMTS13-T7蛋白包板，ELISA檢測免疫后balb/c雌性小鼠抗血清效價(jià)約為1:20000。取小鼠脾臟，制成單細(xì)胞懸液與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞以10:1的比例混合，進(jìn)行細(xì)胞的融合。將融合雜交瘤細(xì)胞稀釋至96孔板后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。兩周后觀察96孔板中是否有克隆，選生長良好的克隆孔檢測，陽性克隆孔擴(kuò)大培養(yǎng)并再次檢測。初步檢測結(jié)果顯示已獲得多株分泌抗