人工合成E-選擇素對兔頸總動脈瘤壁平滑肌細(xì)胞增殖活性的影響及機(jī)制探討.pdf

1、第一部分：實(shí)驗(yàn)性免頸總動脈瘤模型的建立及模型動脈瘤壁平滑肌細(xì)胞的增殖變化
　　 研究背景及目的：蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是威脅生命的主要疾病之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，75％以上的蛛網(wǎng)膜下腔出血由顱內(nèi)動脈瘤(intracranial aneurysm，IA)破裂引起。目前，破裂動脈瘤僅限于外科手術(shù)夾閉和血管內(nèi)介入治療，且具有相當(dāng)?shù)娘L(fēng)險(xiǎn)和一定的并發(fā)癥。因此，探討顱內(nèi)動脈瘤形成、發(fā)展和破裂的病理機(jī)制

2、，特別是對動脈瘤壁是否存在修復(fù)的可能性的探討具有重要意義。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)是平滑肌細(xì)胞層的重要組成部分。VSMC在正常的生理分化狀態(tài)下不表現(xiàn)增殖能力，但是當(dāng)環(huán)境改變時(shí)VSMC可發(fā)生可逆的表型轉(zhuǎn)換，表現(xiàn)為喪失正常成熟細(xì)胞的生理功能并獲得增殖能力。可見，血管壁平滑肌細(xì)胞的生理功能改變是動脈瘤修復(fù)的基礎(chǔ)。動脈瘤形成過程是一個(gè)動脈破壞和修復(fù)的可逆過程，修復(fù)主要表現(xiàn)為中膜層平滑肌

3、細(xì)胞的增殖和遷移。我們用彈性蛋白酶(elastase，EA)滴注法成功誘導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)動物動脈瘤模型，該方法易重復(fù)，成本低，形態(tài)及病理特點(diǎn)更接近人體顱內(nèi)動脈瘤。我們擬通過對模型動脈瘤壁平滑肌細(xì)胞增殖活性的研究，探討顱內(nèi)動脈瘤壁的修復(fù)的可能性。
　　 方法：(1)新西蘭大白兔30只，雌雄各半，隨機(jī)分成4組，A組（對照組），B、C、D、E組為實(shí)驗(yàn)組（其中B組為1周組，C組為2周組，D組為3周組，E組為4周組），每組6只，自由攝水和進(jìn)食，室

4、溫20-25℃，獨(dú)籠飼養(yǎng)，術(shù)前禁水禁食12h。(2)游標(biāo)卡尺測量距右頸內(nèi)外動脈分叉處近端約0.5cm～1.0cm頸總動脈(commoncarotidartery,CCA)直徑，手術(shù)顯微鏡下輕輕剝離該部表面的纖維結(jié)締組織，抽取50μ/ml的彈性蛋白酶0.2ml滴注其表面，對照組用PBS滴注，20min后通過兔耳緣靜脈緩慢推注肝素納500u。(3)1周后行兔頸總動脈系統(tǒng)CT血管造影(CTA)分別觀察對照組和實(shí)驗(yàn)組兔右頸總動脈滴注部位血管的形

5、態(tài)改變和動脈瘤發(fā)展情況。(4)按照實(shí)驗(yàn)動物分組，從手術(shù)日起每隔1周處死一組實(shí)驗(yàn)動物，處死前測量動脈瘤的頸寬、瘤高，收集頸總動脈瘤標(biāo)本（對照組于手術(shù)后1周取標(biāo)本）。(5)對動脈瘤標(biāo)本進(jìn)行HE染色和光鏡檢查。(6)一部分標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，對α-SMA、PCNA、MMP-2蛋白表達(dá)情況進(jìn)行對比研究。(7)對另一部分標(biāo)本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timePCR)檢測OPNmRNA和MMP-2mRNA的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：

6、(1)影像學(xué)檢查結(jié)果：1周后兔頸總動脈系統(tǒng)CTA檢查發(fā)現(xiàn)。24只實(shí)驗(yàn)兔均發(fā)現(xiàn)右側(cè)頸總動脈作用血管段形成明顯的梭形或囊狀動脈瘤，其中部分可見血栓形成，且有血管閉塞現(xiàn)象，對照組未發(fā)現(xiàn)動脈瘤樣病變；在兔處死前用游標(biāo)卡尺測量動脈瘤的頸寬、瘤高。C組分別與B組相比，動脈瘤高度和寬度增大較明顯(p＜0.05)，而與D、E組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。(2)病理檢查結(jié)果顯示：兔頸總動脈瘤壁內(nèi)膜破壞并逐漸消失，彈性纖維斷裂，平滑肌細(xì)胞萎縮，

7、平滑肌細(xì)胞數(shù)目和層數(shù)減少。(3)免疫組化檢測結(jié)果顯示：MMP-2實(shí)驗(yàn)組與對照組相比表達(dá)均有明顯增加(p＜0.05)；其中C組表達(dá)最高，與B、D、E組相比，差異顯著(p＜0.05)：而E組與D組比較，表達(dá)下降但差異不明顯(p＞0.05)。PCNA實(shí)驗(yàn)組與對照組相比表達(dá)均有明顯增加(p＜0.05)；其中B組表達(dá)最高，與C、D、E組相比，差異顯著(p＜0.05)；而C、D、E組表達(dá)逐漸下降，但差異不明顯(p＞0.05)。α-SMA實(shí)驗(yàn)組與對照

8、組相比表達(dá)均有明顯降低(P＞0.05)；其中B、C、D、E組表達(dá)逐漸下降，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。表明，α-SMA在對照組表達(dá)最高，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)逐漸降低；PCNA、MMP-2在對照組表達(dá)甚微，PCNA表達(dá)1周時(shí)最高，隨后逐漸下降，MMP-2在2周時(shí)表達(dá)最高。(4)Real-timePCR檢測結(jié)果顯示：：MMP-2實(shí)驗(yàn)組與對照組相比表達(dá)均有明顯增加(p＜0.05)；其中C組表達(dá)最高，與B、D、E組相比，差異顯著(p＜0.0

9、5)；而D組與E組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。OPN實(shí)驗(yàn)組與對照組相比表達(dá)均有明顯增加(p＜0.05)。對照組表達(dá)甚微，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)逐漸升高，B、C、D、E組各組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 結(jié)論：(1)彈性蛋白酶滴注誘導(dǎo)法建立的動脈瘤模型，方法簡便，易重復(fù)，成本低，且效果確切，模型較穩(wěn)定。此模型在動脈瘤形態(tài)、組織病理、形成發(fā)展機(jī)制上較接近人顱內(nèi)動脈瘤，既可用于病因和發(fā)病機(jī)制的研究，也可用于治療方

10、面的研究，是目前較為理想的動脈瘤模型之一。(2)平滑肌細(xì)胞數(shù)目和層數(shù)的減少在動脈瘤形成過程中起著關(guān)鍵作用，MMP-2分泌的增多是引起平滑肌層改變的重要原因。(3)動脈瘤形成過程中動脈瘤壁平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生增殖，且VSMC由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化以修復(fù)變形的動脈瘤壁。
　　 第二部分：人工合成E選擇素對兔頸總動脈瘤壁平滑肌細(xì)胞增殖活性的影響及機(jī)制探討
　　 研究背景及目的：顱內(nèi)動脈瘤破裂是引發(fā)蛛網(wǎng)膜下腔出血的主要原因，具有極高的致

11、死率和致殘率。目前，破裂動脈瘤僅限于外科手術(shù)夾閉和血管內(nèi)介入治療，對動脈瘤壁的修復(fù)研究甚少。但是隨著當(dāng)今生物治療和基因治療的發(fā)展，對動脈瘤的藥物修復(fù)等非手術(shù)治療將擁有很大的發(fā)展前景。顱內(nèi)動脈分為內(nèi)皮層、平滑肌細(xì)胞層和外膜層，當(dāng)發(fā)生動脈瘤時(shí)，內(nèi)皮層首先破壞，然后產(chǎn)生內(nèi)彈力層的斷裂和消失，接著是平滑肌細(xì)胞的退變與平滑細(xì)胞層數(shù)的減少，最后是外膜破壞與動脈瘤破裂。在整個(gè)動脈瘤形成過程中平滑肌細(xì)胞層的退變尤為顯著，而且是一個(gè)破壞與修復(fù)的可逆過程，

12、但由于血流切應(yīng)力和炎癥的影響使得破壞的程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于修復(fù)，最終導(dǎo)致動脈瘤破裂。因此，探討顱內(nèi)動脈瘤形成過程中平滑肌細(xì)胞的增殖活性，將成為動脈瘤壁修復(fù)研究的基礎(chǔ)。本部分在第一部分利用彈性蛋白酶滴注法誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性兔頸內(nèi)動脈動脈瘤模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用人工合成E選擇素進(jìn)行干預(yù)，以觀察炎癥和動脈瘤壁平滑肌細(xì)胞增殖活性的關(guān)系，為顱內(nèi)動脈瘤壁的修復(fù)研究提供依據(jù)。
　　 方法：(1)新西蘭大白兔24只作為治療組，雌雄各半，隨機(jī)分成4組，分別為F、G、

13、H、I組（其中F組為1周組，G組為2周組，H組為3周組，I組為4周組），每組6只，自由進(jìn)水和攝食，室溫20～25℃，獨(dú)籠飼養(yǎng)，術(shù)前禁水禁食12h。(2)與第一部分相同，建立實(shí)驗(yàn)性兔頸總動脈瘤模型。(3)將各組兔右側(cè)耳緣靜脈埋置24GY型靜脈留置針，沿兔耳緣靜脈注射人工合成E-選擇素2mg/(kg·w)，分別至第1、2、3、4周末處死。(4)1周后行兔頸總動脈系統(tǒng)CTA分別觀察治療組組兔右側(cè)頸總動脈滴注局部血管的形態(tài)改變和動脈瘤發(fā)展情況。

14、(5)按照實(shí)驗(yàn)動物分組，從手術(shù)日起每隔1周處死一組實(shí)驗(yàn)動物，處死前測量動脈瘤的頸寬、瘤高，收集頸內(nèi)動脈瘤標(biāo)本。(6)對標(biāo)本進(jìn)行HE染色和光鏡檢查。(7)對標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，對α-SMA、PCNA和MMP-2蛋白表達(dá)情況進(jìn)行研究。(8)對標(biāo)本進(jìn)行進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-timePCR）檢測OPNmRNA和MMP-2mRNA表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：(1)影像學(xué)檢查和大體測量結(jié)果顯示：1周后兔頸內(nèi)動脈系統(tǒng)CTA檢查發(fā)現(xiàn)，

15、24只治療組兔右頸總動脈作用血管段均發(fā)現(xiàn)有梭形或囊狀動脈瘤形成，其中少部分瘤壁有血栓形成，G、H、I組分別與C、D、E組相比，其動脈瘤高度和寬度均有明顯減小(p＜0.05)，而F組與B組相比，動脈瘤高度和寬度減小不明顯(p＞0.05)。(2)病理檢查結(jié)果顯示：治療組動脈瘤壁與實(shí)驗(yàn)組相比，平滑肌細(xì)胞數(shù)目和層數(shù)減少的程度明顯下降，彈性纖維斷裂和平滑肌細(xì)胞降解的程度亦有減輕。(3)MMP-2治療組與實(shí)驗(yàn)組相比表達(dá)均有不同程度減少；其中F組與B

16、組、G組與C組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；其余兩時(shí)間段兩組比較，差異不明顯(p＞0.05)。PCNAF組與B組、G組與C組相比，表達(dá)明顯減少(p＜0.05)；而H組和D組相比，表達(dá)升高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；I組和E組相比，表達(dá)升高但不明顯(p＞0.05)。α-SMA治療組與實(shí)驗(yàn)組相比表達(dá)均有不同程度減少；其中E組與I組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；其余各時(shí)間段兩組比較，差異明顯(p＜0.05)。(4)P

17、CR檢測結(jié)果顯示：OPN治療組與實(shí)驗(yàn)組相比表達(dá)均有不同程度升高；其中E組與I組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)；其余各時(shí)間段兩組比較，差異明顯(p＜0.05)。MMP-2治療組與實(shí)驗(yàn)組相比表達(dá)均有不同程度減少：其中F組與B組、G組與C組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；其余時(shí)間段兩組比較，差異不明顯(p＞0.05)。
　　 結(jié)論：(1)人工合成E-選擇素可以抑制兔頸總動脈瘤壁平滑肌細(xì)胞數(shù)目和層數(shù)的減少，減輕彈性纖維