活細(xì)胞內(nèi)篩選地塞米松衍生物作用靶蛋白的研究.pdf

1、第一部分糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合域誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 目的:構(gòu)建糖皮質(zhì)激素受體α配體結(jié)合域(GRα-LBD)的誘餌表達(dá)載體，為小分子配體酵母三雜交系統(tǒng)的建立奠定基礎(chǔ)。 方法 RT-PCR擴(kuò)增K562細(xì)胞的GRα-LBD，克隆入誘餌載體pGBKT7中，測序正確后，再把構(gòu)建好的誘餌載體pGBKT7-GRα-LBD轉(zhuǎn)化到酵母AH109細(xì)胞中，提取酵母蛋白，并用Western blot分析誘餌蛋白的表達(dá)情況。同時檢測誘餌蛋白的毒

2、性、滲漏和自激活作用。 結(jié)果:成功擴(kuò)增了GRα-LBD，并分別成功克隆到pGBKT7中，測序結(jié)果正確。誘餌載體成功轉(zhuǎn)化到酵母AH109細(xì)胞中，無毒性、滲漏和自激活作用，Western blot分析也證實了酵母細(xì)胞表達(dá)誘餌蛋白。 結(jié)論:成功構(gòu)建了GRα-LBD酵母誘餌表達(dá)載體，為建立小分子配體酵母三雜交系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。 第二部分人K562細(xì)胞cDNA文庫的擴(kuò)增、純化、鑒定和酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化 目的:對預(yù)轉(zhuǎn)化到大腸

3、DH5α中的人K562細(xì)胞cDNA文庫進(jìn)行擴(kuò)增，純化和鑒定并將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母為下一步的靶蛋白的篩選做準(zhǔn)備。 方法:對K562細(xì)胞cDNA文庫進(jìn)行擴(kuò)增，提取文庫質(zhì)粒，將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母Y187細(xì)胞，并用PCR和酶切鑒定轉(zhuǎn)化結(jié)果。 結(jié)果:成功的擴(kuò)增人K562細(xì)胞cDNA文庫，并驗證了文庫的多樣性，將文庫質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化酵母Y187細(xì)胞。 結(jié)論: K562細(xì)胞cDNA文庫的成功擴(kuò)增，純化，鑒定，為進(jìn)一步的文庫篩選奠定了基

4、礎(chǔ)。 第三部分酵母三雜交技術(shù)篩選地塞米松衍生物作用的靶蛋白 目的:通過酵母三雜交技術(shù)在人K562細(xì)胞cDNA中篩選地塞米松衍生物作用的靶蛋白。 方法:通過將轉(zhuǎn)化有誘餌質(zhì)粒pGBKT7-GRα-LBD的酵母AH109細(xì)胞、轉(zhuǎn)化有文庫質(zhì)粒的酵母Y187細(xì)胞和終濃度為0.4μg/ml的地塞米松衍生物三種物質(zhì)放到一起交配后，將交配后的細(xì)胞鋪于SD/-Trp/-Leu/-His的缺陷培養(yǎng)基上，然后將SD/-Trp/-Leu/-

5、His培養(yǎng)基上生長的克隆挑取到SD/Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal的缺陷培養(yǎng)基上進(jìn)行營養(yǎng)缺陷篩選，重復(fù)挑取三次后仍為藍(lán)色的克隆可能是陽性克隆，然后提取酵母質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取大腸桿菌DH5α中的質(zhì)粒，并通過對所提取的所有文庫質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增和對PCR產(chǎn)物的單酶切分析，將文庫質(zhì)粒歸類，歸類后從每一類中隨機(jī)選擇一個代表，通過酵母回轉(zhuǎn)實驗進(jìn)行驗證。酵母回轉(zhuǎn)實驗陽性的質(zhì)粒送上海生工測序，通過對測序結(jié)

6、果的比對和進(jìn)一步的分析來確定所篩選到的靶蛋白的特征。 結(jié)果:共測序43個，其中有6個是重復(fù)的，實際上我們共篩選到37個不同的蛋白，經(jīng)過回轉(zhuǎn)實驗驗證，證明20個是陽性克隆，其中一個是新蛋白。從中選擇6個進(jìn)行一對一的酵母交配實驗后，發(fā)現(xiàn)DDX28和RanBP9/RanBPM是與地塞米松衍生物相互作用的靶蛋白。 結(jié)論:本研究我們篩選到了2個與地塞米松衍生物相互作用的靶蛋白，分別是DDX28和RanBP9/RanBPM。這將為地