小麥黃色素合成途徑中Psy基因的克隆與分子特性及黃色素含量DH群體的構(gòu)建.pdf

1、本研究以已經(jīng)發(fā)表的玉米Psy基因?yàn)榛A(chǔ),從YPC差異顯著的中國(guó)小麥品種(系)中克隆普通小麥Psy基因,并進(jìn)行分子特性和YPC分析；同時(shí)選擇YPC差異顯著的小麥品種組配F1與玉米遠(yuǎn)緣雜交,誘導(dǎo)可進(jìn)行黃色素含量遺傳分析的小麥雙單倍體(Double Haploid,DH)群體,旨在明確Psy基因?qū)π←淵PC的影響、開發(fā)小麥YPC的分子標(biāo)記,同時(shí)為小麥YPC的遺傳分析、高(低)YPC小麥新品種的選育提供遺傳材料和新種質(zhì)。主要結(jié)果如下：

2、1.小麥黃色素合成途徑中Psy基因的克隆及分子特性利用玉米Psy基因和小麥EST序列設(shè)計(jì)引物克隆小麥Psy基因并測(cè)序,同時(shí)和玉米Psy基因進(jìn)行序列比對(duì)分析。結(jié)果表明,5對(duì)引物Psy01、Psy03～Psy06在YPC不同的小麥樣品中分別擴(kuò)增出989bp、785 bp、1192 bp、690 bp和302 bp的5條帶,同一引物在不同YPC品種中的PCR產(chǎn)物序列一致,經(jīng)比對(duì)分析,5條序列均為Psy基因(片段),并由此組裝成一條全長(zhǎng)3437

3、bp、包括6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子的小麥Psy基因。文中以引物Psy04為例對(duì)其擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行了詳細(xì)的分子特性分析。 2.小麥Psy基因的等位變異及其對(duì)黃色素含量的影響根據(jù)已發(fā)表的麥族植物Psy基因序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物Psy02,克隆小麥Psy基因。結(jié)果表明,該引物下PCR產(chǎn)物出現(xiàn)3種帶型：196bp、233bp和489bp,其中196bp和233bp條帶涵蓋了小麥Psy基因第2外顯子全部序列,相差的37bp為Psy基因第2

4、內(nèi)含子中的一段插入序列,可反映不同YPC,屬小麥Psy基因的等位變異。驗(yàn)證試驗(yàn)表明,248份試材(包括229份中國(guó)小麥微核心種質(zhì)和19份品質(zhì)性狀典型的小麥品種)中有153份材料(占樣品數(shù)的65.7％)擴(kuò)增出196bp條帶,群體內(nèi)YPC均值7.314mg/kg,屬高YPC范疇；另有95份材料(占樣品總數(shù)的38.3％)擴(kuò)增出233bp條帶,群體內(nèi)YPC均值為5.207mg/kg,屬低YPC范疇,方差分析表明二者YPC差異達(dá)1％極顯著水平差異

5、,說明上述37bp的插入序列是導(dǎo)致小麥品種間YPC產(chǎn)生差異的原因之一,因此該引物擴(kuò)增的Psy基因?qū)π←淵PC具有顯著影響,引物Psy02是對(duì)小麥YPC進(jìn)行分子鑒定的重要標(biāo)記。序列分析表明,196bp和233bp與設(shè)計(jì)引物的探針序列100％同源,489bp序列的BLAST搜索顯示,與序列EU096094(未定位)的同源率最高,達(dá)97％,與7A染色體上序列EF600063和7B染色體上序列DQ642439的同源率均為85％,表明該基因片段可

6、能為7A和7B染色體以外的另一Psy基因。結(jié)合該序列對(duì)應(yīng)小麥品種的高YPC,推測(cè)該基因和7A染色體的Psy基因?qū)S色素含量存在積加效應(yīng)。 3.普通小麥DD染色體上Psy基因的發(fā)現(xiàn)及其等位變異以擴(kuò)增小麥Psy基因的相應(yīng)引物Psy01～Psy06,在節(jié)節(jié)麥(2X=DD=14)中進(jìn)行PCR反應(yīng)。結(jié)果表明,僅引物Psy02和Psy06能擴(kuò)增出特異條帶。引物Psy02的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)206bp,與普通小麥中擴(kuò)增的196bp序列同源率為93.0

7、％,對(duì)應(yīng)的第2外顯子區(qū)域內(nèi)僅有1SNP;引物Psy06的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)305bp,與普通小麥中擴(kuò)增的302bp序列同源率達(dá)95.77％,對(duì)應(yīng)的第6外顯子區(qū)域內(nèi)無(wú)SNP,說明在小麥DD染色組中存在Psy基因,同時(shí)也排除了將引物Psy01、Psy03、Psy04、Psy05的擴(kuò)增產(chǎn)物和引物Psy02的489bp擴(kuò)增產(chǎn)物定位于D染色體的可能。 4.小麥黃色素含量DH群體的構(gòu)建為獲得一定規(guī)模的小麥單倍體以構(gòu)建小麥黃色素含量的DH群體,用高

8、/低YPC小麥品種組配F1,F1再和玉米遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)小麥單倍體,研究了環(huán)境溫度對(duì)單倍體成胚率、幼胚取材時(shí)期、幼胚大小、4℃處理時(shí)間、暗處理時(shí)間對(duì)單倍體成苗率的影響。結(jié)果表明,獲得最高成胚率的環(huán)境溫度為21～23℃,授粉后12～16天取材的幼胚成苗率無(wú)明顯差異；0.5～1.0mm大小的幼胚成苗率顯著高于0～0.5mm和1.O～1.5mm大小的幼胚成苗率；1～3天短期4℃處理對(duì)胚萌發(fā)具有一定促進(jìn)作用,但處理3天后,出愈率和成苗率都將降低；胚