肝細胞癌基因組后由數(shù)畸變區(qū)域內(nèi)相關(guān)基因的功能及分子機理研究.pdf

1、肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，占全球癌癥相關(guān)死亡的第三位，其高發(fā)地區(qū)主要位于東亞(包括蒙古)、東南亞以及撒哈拉以南非洲地區(qū)。然而關(guān)于這一致命性疾病的發(fā)病機制仍不十分清楚，其發(fā)生、發(fā)展的分子機理亟待闡明。目前，一種用來發(fā)掘腫瘤相關(guān)基因的有效方法是在頻繁發(fā)生異常改變的基因組區(qū)域中尋找潛在的候選基因。通過以往的研究，在肝癌基因組中已發(fā)現(xiàn)一些常見的拷貝數(shù)畸變(Cop

2、y number alteration，CNA)區(qū)域，然而它們大多應(yīng)用較低分辨率的研究技術(shù)，因此僅提供了一個較為局限的肝癌基因組拷貝數(shù)畸變概貌。為解決這一問題，本研究首先應(yīng)用最新的Affymetrix single nucleotidepolymorphism6.0(SNP6.0)芯片分析58對肝癌原發(fā)灶及癌旁肝組織的DNA拷貝數(shù)改變，發(fā)現(xiàn)1，241個拷貝數(shù)畸變(CNA)區(qū)域，包括963個擴增區(qū)和278個缺失區(qū)。隨后，通過整合性分析拷貝

3、數(shù)畸變與基因表達譜數(shù)據(jù)，獲得362個位于拷貝數(shù)畸變區(qū)域中的差異表達基因，并對這362個基因進行基因功能(Gene ontology，GO)及相互作用網(wǎng)絡(luò)(Network)分析，一方面發(fā)現(xiàn)了一些關(guān)鍵生物學(xué)過程和信號通路在肝癌中發(fā)生異常改變，另一方面獲得了一些位于相互作用網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點的基因，為篩選候選基因進行功能研究提供了依據(jù)。通過系列體內(nèi)外功能實驗檢測20個候選基因?qū)Ω伟┘毎鲋衬芰Φ挠绊?，發(fā)現(xiàn)1個新的候選抑癌基因TRIM35(trip

4、artite motif-containing35)和2個新的候選癌基因HEY1(hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif1)與SNRPE(small nuclear ribonucleoprotein polypeptide E)。進一步研究發(fā)現(xiàn)TRIM35基因通過阻滯細胞周期于G2/M期和促進細胞凋亡而發(fā)揮其抑制肝癌細胞增殖的作用。此外，通過免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)TRIM35基因在肝癌

5、組織中蛋白表達水平與肝癌的組織學(xué)分級、腫瘤大小以及血清AFP水平等臨床病理學(xué)指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)。最后，通過對肝癌基因組中新發(fā)現(xiàn)的拷貝數(shù)擴增位點1q24.1-24.2進行深入研究，發(fā)現(xiàn)一個新的肝癌轉(zhuǎn)移促進基因MPZL1(myelin proteinzero-like l)，其表達水平與肝癌的組織學(xué)分級和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移等臨床病理學(xué)指標(biāo)呈正相關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)MPZL1基因能夠通過誘導(dǎo)Cortactin蛋白的磷酸化水平增加與激活而發(fā)揮其促轉(zhuǎn)移功能，且這一

6、信號傳導(dǎo)過程依賴Src蛋白激酶活性。綜上所述，這些研究結(jié)果表明整合性分析拷貝數(shù)畸變與表達譜數(shù)據(jù)能夠有效地發(fā)掘新的腫瘤相關(guān)基因，為肝癌發(fā)病機制的闡明提供了新的理論依據(jù)。
　　 第一部分肝細胞癌基因組拷貝數(shù)畸變?nèi)胺治?br>　　 過往研究在肝癌中已鑒定出一些常見的CNA，但它們主要采用相對較低分辨率的檢測技術(shù)，從而只能提供一個較為局限的肝癌基因組拷貝數(shù)畸變概況。為此，本研究擬采用人全基因組SNP6.0芯片來檢測肝癌全基因組拷貝數(shù)

7、畸變圖譜。通過應(yīng)用高分辨率SNP6.0芯片檢測58例肝癌原發(fā)灶及癌旁肝組織DNA、利用Partek軟件包對芯片原始數(shù)據(jù)進行挖掘并分析拷貝數(shù)畸變情況、參考UCSC hg18版本基因組序列對CNA進行基因組定位分析以及運用統(tǒng)計學(xué)方法篩選出肝癌基因組中具有顯著意義的CNA位點，最終在肝癌基因組中共發(fā)現(xiàn)1，241個顯著CNA位點，包括963個擴增和278個缺失位點。這些位點中部分與以往在肝癌中發(fā)現(xiàn)的CNA位點高度相符，例如8q，1q，7q，6p

8、，17q和20q等位點的擴增以及8p，4q，16q和17p等位點的缺失。此外，在肝癌基因組中還發(fā)現(xiàn)很多新的CNA位點，包括1p，2q，3q，6q，8p，9p，10p，13q，18p，19p和22q等擴增位點及3q，4p，8q，12p，14q和18q等缺失位點。本研究為進一步尋找肝癌基因組拷貝數(shù)畸變區(qū)域內(nèi)候選腫瘤相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分肝細胞癌拷貝數(shù)畸變區(qū)域內(nèi)相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析
　　 高通量基因組檢測技術(shù)

9、可以對數(shù)以千計的腫瘤樣本基因組進行分析，然而如何從產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)中篩選出真正的腫瘤相關(guān)基因?qū)⑹且粋€巨大的挑戰(zhàn)。為篩選肝癌基因組中拷貝數(shù)畸變相關(guān)基因，本研究首先對肝癌基因組拷貝數(shù)畸變與轉(zhuǎn)錄組差異表達譜數(shù)據(jù)進行整合性分析，獲得了362個位于拷貝數(shù)畸變區(qū)域中的差異表達基因，包括292個位于擴增區(qū)域中的上調(diào)基因和70個位于缺失區(qū)域中的下調(diào)基因，并進一步采用生物信息學(xué)分析方法對這362個基因進行GO及Network分析，一方面可以發(fā)現(xiàn)肝癌發(fā)生、發(fā)

10、展過程中一些核心的生物學(xué)過程發(fā)生異常改變，包括DNA復(fù)制/mRNA加工，細胞周期/細胞增殖，蛋白質(zhì)運輸/蛋白質(zhì)折疊，細胞粘附/細胞運動等；另一方面可以發(fā)現(xiàn)很多生物學(xué)過程和信號通路之間通過一些關(guān)鍵基因相互聯(lián)系，例如GNAO1、GNAZ、PLCB1、CDC25B、LAMC1、FOS、ETS1和SHC1等。最終，通過上述綜合性分析結(jié)合文獻查詢，我們挑選出20個候選基因準(zhǔn)備進行后續(xù)功能分析，并通過定量PCR技術(shù)驗證其在肝癌組織中表達水平。綜上所

11、述，通過整合性分析及聯(lián)合生物信息學(xué)分析能夠有效地從冗長的基因列表中挑選出候選基因，為后續(xù)腫瘤相關(guān)基因的鑒定及分子機理研究奠定基礎(chǔ)。
　　 第三部分缺失區(qū)域內(nèi)候選抑癌基因TRIM35的功能及初步機理研究
　　 前兩部分的研究共獲得20個候選基因，為進一步確定它們在肝癌發(fā)生過程中所發(fā)揮的作用，本研究擬對這20個基因的生物學(xué)功能和初步機理進行分析。首先構(gòu)建了20個基因的慢病毒表達載體并分別建立穩(wěn)定表達肝癌細胞株，隨后通過各種體

12、內(nèi)外實驗檢測20個基因?qū)Ω伟┘毎鲋衬芰Φ挠绊?，發(fā)現(xiàn)1個新的候選抑癌基因(TRIM35)和2個新的候選癌基因(HEY1和SNRPE)。進一步通過對細胞周期和細胞凋亡的分析，發(fā)現(xiàn)TRIM35基因一方面通過將細胞周期阻滯于G2/M期，另一方面通過促進細胞凋亡，從而抑制肝癌細胞的增殖。最后，通過免疫組化實驗檢測了207對肝癌組織及相應(yīng)癌旁肝組織中TRIM35蛋白表達水平，并將其與多項臨床病理學(xué)指標(biāo)進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)TRIM35蛋白水平與肝癌

13、的組織學(xué)分期、腫瘤大小及血清AFP水平等三項臨床病理學(xué)指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)。
　　 第四部分?jǐn)U增區(qū)域內(nèi)MPZL1基因在肝細胞癌轉(zhuǎn)移中的作用及機理研究
　　 本研究通過整合性分析拷貝數(shù)畸變與基因表達譜數(shù)據(jù)，以及利用系列體內(nèi)外功能性實驗，發(fā)現(xiàn)肝癌基因組中1q24.1-24.2位點的頻繁拷貝數(shù)擴增能夠引起MPZL1基因表達水平的上調(diào)，進而導(dǎo)致肝癌細胞轉(zhuǎn)移能力的增強。而且MPZL1基因表達水平的增加與肝癌的組織學(xué)分級及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移等臨床病理

14、學(xué)指標(biāo)呈正相關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)MPZL1基因增強肝癌細胞轉(zhuǎn)移能力的機制之一可能為導(dǎo)致Cortactin蛋白的磷酸化水平增加。Cortactin為一種細胞內(nèi)廣泛分布的肌動蛋白結(jié)合蛋白，在多種腫瘤組織中表達水平上調(diào)且能夠促進腫瘤的惡性進展與轉(zhuǎn)移。此外，通過應(yīng)用Src激酶小分子抑制劑與顯性負(fù)突變體(Donunant negative mutant)，發(fā)現(xiàn)Src蛋白激酶能夠介導(dǎo)MPZL1基因過表達引起的Cortactin蛋白的磷酸化水平增加與激