老年性癡呆（阿爾茨海默病）β淀粉樣蛋白人源抗體的體外篩選和表達(dá).pdf

1、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文老年性癡呆（阿爾蔣海默?。│碌矸蹣拥鞍兹嗽纯贵w的體外篩選和表達(dá)姓名：蔡炯申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：核醫(yī)學(xué)與影像醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：王世真2003.1.1中固拂和醫(yī)科人學(xué)博∽i】I_究生論文3洗脫。SDS—PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)表明，從表達(dá)細(xì)菌的超聲上清液中純化得到分子量大小不等的5條帶，沉淀中純化得到一條帶。WesternBlot證實(shí)，從細(xì)菌不溶性沉淀中純化得到的純度較高的約32Kda的蛋白質(zhì)為我們表達(dá)得到的A

2、040的單鏈抗體，并帶有His6和cmyctag。而上清液中純化得到的單鏈抗體已經(jīng)被降解。用c—myc的單克隆抗體進(jìn)行單鏈抗體的抗原結(jié)合能力進(jìn)行分析，El。ISA測(cè)試證實(shí)從細(xì)菌不溶性沉淀中純化得到的純度較高的單鏈抗體保持了結(jié)合AB40的生物活性。將單鏈抗體基因克隆插入酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K，電穿孔法轉(zhuǎn)化KM71和GSll5酵母細(xì)胞系，共得到81個(gè)克隆。通過(guò)甲醇誘導(dǎo)，對(duì)其中78個(gè)克隆進(jìn)行了表達(dá)。卜清液的SDS—PAGE和銀染分析，確定其

3、中的6個(gè)克隆在誘導(dǎo)的第6天分泌了單鏈抗體。對(duì)這六個(gè)克隆進(jìn)行抗體分泌時(shí)間的分析，發(fā)現(xiàn)抗體在誘導(dǎo)后的72小時(shí)左右分泌量達(dá)到最高。本項(xiàng)研究的另一個(gè)目的是獲得適合于l臨床治療研究應(yīng)用的老年性癡呆抗體藥物。將單鏈抗體基因的重鏈區(qū)域和輕鏈區(qū)域分別擴(kuò)增，最后先后分別插入昆蟲(chóng)桿狀病毒重組表達(dá)系統(tǒng)pPAC—L—CH3中，和野生的線性化的昆蟲(chóng)病毒DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞SF9。通過(guò)熒光免疫分析表明在轉(zhuǎn)染后的6天，完整的人的單克隆抗體從昆蟲(chóng)細(xì)胞向培養(yǎng)基中分泌。關(guān)